《Microorganisms》：Probiotic Characterization and Safety Assessment of Marine Bacillus Isolates from Diverse Biotopes
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在现代水产养殖中，寻找抗生素替代品的需求要求益生菌筛选策略整合功能有效性与生物安全性。本研究提出一种评分-热图（scoring–heatmap）方法，用于从不同海洋生境中鉴定益生菌候选株，并评估分离来源对益生菌筛选的影响。自鲻鱼（Chelon labrosus
在现代水产养殖中，寻找抗生素替代品的需求要求益生菌筛选策略整合功能有效性与生物安全性。本研究提出一种评分-热图（scoring–heatmap）方法，用于从不同海洋生境中鉴定益生菌候选株，并评估分离来源对益生菌筛选的影响。自鲻鱼（Chelon labrosus）皮肤黏液与肠道、金头鲷（Sparus aurata）肠道及斯法克斯海水中共分离获得61株细菌菌株。其中，9株对Lactococcus garvieae、Vibrio anguillarum、Vibrio harveyi、Aeromonas hydrophila及Photobacterium damselae subsp. damselae表现出强抗菌活性，遂对其开展结合功能特性与关键安全性标准的层级化评价。Bacillus subtilis D6与Bacillus pumilus D9及EM7成为最具前景的候选株，因其广谱病原抑制、显著黏附能力、疏水性高于70%以及24 h后自聚集高于90%而获得最高评分。分子分析证实其不携带肠毒素与毒力基因，而在欧洲舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）体内试验中，注射D6、D9与EM7的鱼在10天注射后观察期内未出现死亡或明显临床症状。所观察到的差异提示生态来源与益生菌特性之间可能存在关联，值得进一步研究。Bacillus subtilis D6与Bacillus pumilus D9及EM7成为可持续水产养殖中有前景的潜在益生菌候选株。
研究背景方面，由Aeromonas、Vibrio、Edwardsiella、Pseudomonas与Streptococcus等病原引起的细菌性疾病是水产养殖的主要挑战。抗生素虽被传统用于控制此类感染，但其密集使用可促进抗菌药物耐药性并扰乱有益微生物群落。益生菌在现代水产养殖中发挥重要作用，被引入作为改善鱼类健康、控制疾病、维持健康环境并提升生产性能且无不良作用的替代途径。在众多益生菌中，芽孢杆菌属（Bacillus spp.）因具芽孢形成能力、稳健性及多种健康促进特性而应用最广。然而，传统上使用陆源益生菌，其在水生宿主与环境条件下的表现可能不同；因此水生动物及其相关环境成为潜在益生菌的宝贵来源。此外，菌株的生态来源可能与其功能特性和生物安全特征的差异相关，但分离来源与益生菌筛选所用不同功能及安全标准之间的关联程度尚研究不足。现有筛选多基于减法方法（不考虑整体益生菌潜力即淘汰菌株）或无监督聚类方法如主成分分析（PCA）与热图分析，而常规热图分析与PCA并非专为将异质性定性与定量标准整合进候选株优先排序的共同框架而设计，且主要依赖功能参数，安全性相关标准常考虑不足。为此，研究人员采用多参数评分方法结合热图分析开展潜在益生菌菌株的筛选与选择，评分系统作为数据整合工具，对定量与定性结果赋予数值，使功能与安全标准得以同时考量，所得评分再纳入热图以整合可视化菌株在全部选择标准上的表现并支持按整体益生菌潜力排序。研究假设为不同生态来源的分离株在功能益生菌性状与生物安全特征上可能存在差异，或反映其对各自宿主相关或环境生态位的适应。本研究旨在采用整合评分-热图方法表征海洋细菌分离株，并比较不同分离来源的益生菌选择标准，通过结合功能与安全性评估及生态来源比较分析，为来源相关益生菌特性差异提供初步认识，并为潜在益生菌候选株的优先排序提供结构化方法。研究得出，Bacillus subtilis D6与Bacillus pumilus D9及EM7为最有前景的潜在益生菌候选株，其意义在于为水产养殖益生菌筛选提供了整合功能与安全标准的结构化框架，并提示生态来源与益生菌特性可能存在关联。
关键技术方法方面（不超过250字）：自鲻鱼（Chelon labrosus）肠道与皮肤黏液、金头鲷（Sparus aurata）肠道及斯法克斯海水采样，每种来源6个生物学重复，经65 °C 30 min热处理选择性分离芽孢形成菌；采用菌落覆盖法（colony overlay）与无细胞上清（CFS）微量板法评估抗菌活性，并行蛋白酶K敏感性、pH中和与热稳定性试验；采用报告菌株Chromobacterium violaceum行群体感应淬灭（QQ）与N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）降解测定；行抗生物膜黏附与清除试验、pH与胆盐耐受、自聚集与共聚集、疏水性、体外黏附（鱼黏液、BSA、聚苯乙烯）及生物膜形成测定；行纸片扩散法药敏、溶血、明胶酶与胆盐水解酶试验、PCR检测毒力与肠毒素基因、SAF-1细胞系MTT细胞毒性试验；经16S rRNA基因测序与MALDI-TOF MS鉴定；采用多参数评分结合层级聚类热图与PCA及敏感性分析；并在欧洲舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）行体内生物安全评价。
研究结果方面：3.1 菌株分离与抗菌活性筛选。自不同生境分离纯化61株菌（鲻鱼19株、金头鲷30株、斯法克斯海水12株），经菌落覆盖法对五种指示病原筛选，仅9株（M4、D6、D7、D9、EM2、EM3、EM6、EM7、EM8）对全部受试病原表现拮抗活性，其中D9与EM6抗菌活性最强；CFS经pH调节后活性稳定，经热处理与蛋白酶K处理后部分或完全丧失；对21株其他鱼类病原表现可变拮抗活性，海水来源株中60%可抑制10种以上指示菌；共培养试验中荧光法与外涂法活力结果多数无显著差异，D6、D9与EM7在1:4比例48 h时抑制作用最强。3.2 表型特征与胞外酶评价。9株中8株为革兰阳性、产内生芽孢、触酶与氧化酶阳性，EM6不产芽孢且氧化酶阴性；D6、D7与EM6耐盐性较低；D6、D7、EM6与EM8同时具淀粉酶、脂肪酶与蛋白酶活性，D6、D9与EM2产胞外多糖。3.3 群体感应淬灭与抗生物膜。D6与EM3呈中等QQ活性，D9、EM6与EM7呈弱活性；D9菌体可降解C12-AHL，D6、EM3与EM6对短链C6-AHL与长链C12-AHL均有降解活性；全部CFS均可抑制并清除V. harveyi生物膜，清除率由24 h的55–75%升至48 h的77–88%。3.4 pH与胆盐耐受。除M4、D7与EM2外，其余菌株在pH 2.0与pH 3.0及10%胆盐暴露4 h后存活率高于75%；D9被鉴定为高度耐受。3.5 自聚集与共聚集。自聚集随培养时间增加，3 h时均低于40%，24 h后D9与EM6最强（92%）；全部菌株与至少一种病原共聚集超过30%，D9与EM3表现高至极高共聚集水平。3.6 疏水性与生物膜。D6疏水性最高（环己烷82.3%、乙酸乙酯与氯仿69%、甲苯72.5%）；全部菌株均具生物膜形成能力，海水来源株中强生物膜生产者比例更高。3.7 黏附试验。全部菌株对黏液黏附率为16–90%，对BSA与聚苯乙烯为3–35%；D6与D9黏附能力超过80%，对海鲈与金头鲷黏液黏附高于鳎黏液。3.8 体外安全性试验。菌株对多数受试抗生素敏感，耐药主要见于氯林肯霉素（20%）、头孢噻吩与卡那霉素（各15%）；仅D6、D9与EM7不携带全部所检毒力基因；除D6、D9、EM3、EM6与EM7为γ-溶血外，其余为α-或β-溶血；SAF-1细胞毒性试验显示多数菌株无有害作用。3.9 菌株鉴定。除EM6鉴定为Serratia marcescens外，其余均为Bacillus spp.，包括B. subtilis（D6、D7、EM3）、B. pumilus（M4、D9、EM7、EM8）与B. zhangzhouensis（EM2）；EM6因属机会致病菌被排除。3.10 潜在益生菌筛选与生物安全。多参数评分结合层级聚类显示D6、D9、EM3与EM7总分最高，M4与D7安全评分为负；热图形成两个主要聚类，第一聚类为EM3、D6、D9与EM7，具最强整体益生菌潜力；敏感性分析中各情景下四株均保持最高评分；体内生物安全试验中，除EM3注射组30尾鱼中20尾（66.7%）一夜内死亡并见出血征象外，仅D6、D9与EM7在10天监测期内无死亡。
讨论部分总结：陆源益生菌常因在水生宿主中存活不佳而效力有限，水生环境是适应水生宿主生理与生态条件的益生菌候选株的重要来源，每株细菌受其生态位塑造，可能影响其对宿主环境的适应与益生菌潜力，但分离来源对益生菌筛选所用功能与安全特征的影响尚研究不足。本研究中9株对全部受试病原表现完全抑制活性，与既往关于鱼类肠道来源芽孢杆菌拮抗活性的报道一致；蛋白酶K处理后活性部分或完全丧失提示蛋白类因子参与，热敏感性提示部分活性成分对温度敏感，但这些试验未确定抑制物的确切身份，需进一步生化表征。荧光法活力测定可作为常规培养法的快速替代。所选菌株产酶差异与既往研究相符，芽孢形成支持其芽孢杆菌属鉴定。QQ活性在培养孔法通常高于菌落点样法，提示两种方法互补。海水环境可能是具QQ潜力细菌的更丰富储库。所试菌株均能抑制并清除生物膜，与既往报道一致。胃肠道耐受性是芽孢杆菌益生菌的关键要求，鱼源菌在胆盐暴露下存活更高，可能部分反映其生态来源，但该解释仍属假设。细胞表面自聚集、共聚集与疏水性是黏附能力的间接指标，但不能直接证明肠道黏附或持续定植，需体内研究验证。海水来源株自聚集较高可能赋予生态优势。黏附是涉及特异性配体-受体与非特异性机制的复杂过程，对聚苯乙烯与BSA黏附有限提示对肠道黏液黏附可能依赖特异性分子相互作用；菌株黏附随表面与鱼种不同而变化，鱼源株对肠道与皮肤黏液黏附强于海水株，提示其对宿主相关环境的适应。安全性评估是益生菌候选株评价的必要步骤，D6、D9与EM7为γ-溶血且不编码肠毒素，对全部受试抗生素敏感。SAF-1细胞试验中多数菌株无有害作用，鱼源菌存在时细胞活力更高，或反映宿主相关细菌与鱼类细胞系的生态相容性，但本研究未设计机制探究。既往研究多采用无监督聚类方法，主要依赖功能参数而安全性标准整合不足，本研究采用多参数评分结合层级聚类，EM3、D6、D9与EM7形成独立亚聚类，兼具有效病原抑制、强定植潜力与良好安全性，而M4与D7虽功能有益但安全评分为负。敏感性分析支持评分-热图方法的稳健性。基于不同海洋生境分离株评分的比较分析显示功能与安全特征随来源存在差异，但本研究仅从初始菌株集合中选取9株（鱼源4株、海水源5株），故所观察模式为初步与描述性的，不能推广至这些来源的全部分离株，需更大且更均衡的菌株集合进一步研究。体内生物安全试验为候选株的初步附加安全检查，并非证明其抗病效力；EM3注射组出现死亡而被排除，凸显体内生物安全评估的重要性。综上，D6、D9与EM7成为水产养殖中有前景的益生菌候选株。
研究结论部分翻译：本研究自海洋生境包括鲻鱼（Chelon labrosus）、金头鲷（Sparus aurata）与斯法克斯海水分离获得61株菌株。其中，基于整合功能与安全标准的多参数评分-热图方法，仅Bacillus subtilis D6与Bacillus pumilus D9及EM7成为有前景的潜在益生菌候选株。该方法为候选株的比较评价与优先排序提供了框架，而非经确证的益生菌效力预测。所选菌株表现出有利的益生菌属性组合，包括高黏附能力、对鱼类病原的广谱拮抗活性以及在体外筛选中无不良性状。其安全性经欧洲舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）体内生物安全评估进一步支持。因此，B. subtilis D6与B. pumilus D9及EM7被鉴定为水产养殖中有前景的益生菌候选株。仍需开展进一步饲喂试验，评价其定植、免疫应答、生长性能及抗病原攻毒能力，以验证其益生菌潜力并确定其在水产养殖中的适用性。
