马尔堡病毒储存宿主埃及果蝠与人类抗病毒反应差异的物种特异性基因程序解析

《Cell Reports》：Species-specific gene programs define divergent antiviral responses in Marburg virus reservoir bats and humans

　　

蝙蝠能够耐受在人类中引发严重疾病的病毒。埃及果蝠（Egyptian rousette bats）作为马尔堡病毒（Marburg virus, MARV）的自然储存宿主，可维持无症状感染，而人类感染后则发展为重症乃至致死性疾病。为阐明这一差异的生物学基础，研究人员建立了一个比较研究框架，利用暴露于双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）和干扰素（interferon, IFN）的原代及永生化埃及果蝠细胞和人类细胞进行研究。蝙蝠细胞上调抗病毒效应分子，同时限制炎症放大因子，这一模式在独立的体内MARV感染数据集分析中得到了进一步支持。相比之下，人类细胞在应对MARV时激活了抗病毒程序与免疫过度活化。通过整合转录组学和蛋白质组学分析，研究人员鉴定了物种特异性免疫程序，涵盖差异化的干扰素刺激基因（IFN-stimulated gene, ISG）调控、凋亡控制和细胞因子信号传导。该研究建立了一个整合性框架，用以理解与MARV储存宿主生物学相关的物种特异性抗病毒反应，鉴定了与人类免疫病理发生相关的通路，并为未来丝状病毒感染宿主反应研究奠定了基础。

一、研究背景与科学问题

蝙蝠属于翼手目（Chiroptera），是仅次于啮齿类的第二大哺乳动物类群。蝙蝠在进化过程中形成了支持长途飞行和冬眠所需的高代谢率，同时也成为多种高致病性人兽共患病毒的天然储存宿主，包括尼帕病毒、狂犬病病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2等。这些病毒在蝙蝠中通常引起亚临床或轻微症状感染，但在人类中却常常致命。这种感染结局的显著差异被推测源于蝙蝠与人类免疫系统之间的重大差异。

已有研究发现，蝙蝠的I型干扰素（type I interferon, IFN）基因座存在独特的进化特征。例如，黑狐蝠（Pteropus alecto）的I型IFN基因座发生收缩，却伴随IFNA的组成性表达；埃及果蝠（Rousettus aegyptiacus）基因组中含有功能活跃的干扰素ω（IFNW）基因的扩张，但I型IFN基因的基线表达水平在体外和体内均有限。然而，以往对蝙蝠免疫系统的研究往往存在过度外推的问题——将某一物种的发现推广至整个属或科，或将某一病毒的研究结论推广至整个病毒属。研究人员指出，每种病毒-宿主（物种对物种）的相互作用可能都经过进化军备竞赛而达到独特的平衡状态，因此任何泛化都可能不恰当。

马尔堡病毒（Marburg virus, MARV）感染埃及果蝠时呈亚临床状态，病毒在暴露后两周内被清除；而在人类中，早期先天免疫反应虽对多数幸存者的病毒控制至关重要，但也可能促进重症进展，导致炎症反应加剧，进而引发细胞因子释放综合征、血管渗漏和弥散性血管内凝血等严重组织损伤。大多数针对埃及果蝠的转录组学研究聚焦于抗病毒反应的保守元件，而埃及果蝠与人类之间发散的先天免疫通路尚未被系统描述。因此，研究人员假设这种比较能够揭示与不同保护机制相关的特异性基因。

二、研究内容与主要发现

研究人员建立了一个比较框架，利用暴露于双链RNA（poly I:C）和干扰素α（IFNA）的原代及永生化埃及果蝠和人类成纤维细胞，通过四象限分析方法鉴定物种特异性基因表达模式。研究发现，埃及果蝠细胞在受到刺激后倾向于上调抗病毒效应分子并限制炎症放大因子，而人类细胞则激活更广泛的炎症和IFN扩增程序。这一物种特异性转录特征在独立的体外病毒感染和IFN刺激数据集、体内基础组织表达数据以及体内MARV感染数据中均得到验证。整合转录组学和蛋白质组学分析进一步确认了这些物种差异在蛋白质水平上的保守性。研究还发现，埃及果蝠的IFNE基因在免疫组织中并无显著差异表达，且不受感染刺激诱导，与人类中该基因的组织特异性表达和非诱导性特征一致。

三、主要技术方法

研究人员采用多组学整合策略。转录组分析中，使用Kallisto对埃及果蝠（Raegyp2.0注释转录组）和人类（GRCh38注释转录组）的RNA测序数据进行定量，通过tximport生成计数矩阵，并利用DESeq2的中位数比值法进行标准化。四象限分析方法（由Hagai等和Schneor等开发）用于分类四组基因：蝙蝠组成性低表达（BCL）、人类组成性低表达（HCL）、蝙蝠诱导高表达（BIH）和人类诱导高表达（HIH）。蛋白质组学分析在平行条件下对埃及果蝠和人类原代成纤维细胞进行UIFNA刺激后开展定量检测。验证阶段整合了多个独立公开数据集，包括埃及果蝠RoNi/7.1细胞（Pavlovich等）、SeV和MARV感染数据（Arnold等）、体内MARV感染数据（Guito等）、人类原代成纤维细胞数据（Hagai等、Rosain等、Bastard等）以及GTEx v18人类组织数据。通路富集分析使用DAVID和gPROFILER工具完成。

四、研究结果

1. 1.
   双链RNA和干扰素α在埃及果蝠和人类成纤维细胞中诱导显著不同的抗病毒反应

通过四象限分析，研究人员在poly I:C和IFNA刺激条件下分别鉴定了四组差异表达基因。BCL基因（如CASP1、DRAM1、EGR1、FOS、PARP14）在埃及果蝠成纤维细胞中基线表达显著低于人类；HCL基因（如IRF1、IL6、CMPK2、NOD2、TLR3）在人类成纤维细胞中基线表达显著低于埃及果蝠；BIH基因（如DHX58、MORC3、CASP8、ZBP1、ENPP4、TOR3A）在埃及果蝠细胞中受刺激后强烈诱导而人类细胞中保持低水平；HIH基因（如CXCL8、CXCL9、CXCL11、MX1、ISG20、RIGI）在人类细胞中受刺激后强烈诱导而埃及果蝠细胞中保持低水平。BIH表达量约为HIH水平的25%，BCL表达量仅为HCL水平的18.8%，表明埃及果蝠成纤维细胞具有较低的基线免疫基因表达和减弱的诱导反应。poly I:C刺激后，人类成纤维细胞上调促炎细胞因子基因（CXCL8、CXCL9），而埃及果蝠细胞优先上调抗原呈递相关基因（HLA-DMA、TAP1）和免疫调节基因（JAK2、SELE）。IFNA刺激后，人类细胞上调CXCL11、HLA-B、ISG20、JAK2和MX1，而埃及果蝠细胞上调SCNN1G、ZBP1、CASP8等免疫调节和凋亡相关基因。

1. 2.
   物种特异性转录程序在独立体外刺激、体内基础组织和体内马尔堡病毒感染中可重复

研究人员利用多个独立数据集验证了四象限分类的可靠性。在体外验证中，BIH基因CASP8和ZBP1以及HIH基因RIGI的表达模式在SeV感染、MARV感染和IFN刺激等不同条件下均得到确认。在体内基础组织验证中，人类组织中CMPK2、IL6、IRF1、NOD2和TLR3的组成性低表达以及埃及果蝠组织中B2M、CASP1、DHX58、DRAM1、DUSP1、EGR1、FOS、IRF7、IRF9、PARP14、UBE2L6和UBA7的低表达均得到证实。在体内MARV感染验证中，UBA7在感染后显著上调，ZBP1在感染果蝠中高度诱导，而TLR3和RIGI的表达在感染后无变化，印证了其人类特异性诱导特征。此外，人类MARV感染生物标志物（CXCL8、CXCL10、IL6、TNF、IFITs、IRF1、RIGI、STAT1、MX1、OAS1、SERPINE1）在人类成纤维细胞poly I:C刺激数据中得到部分验证，埃及果蝠生物标志物（MORC3、RND1）则在果蝠成纤维细胞中得到验证。

1. 3.
   比较蛋白质组学揭示共享干扰素核心但免疫通路参与存在物种差异

定量蛋白质组学分析确认了转录组学预测的物种差异在蛋白质水平上的保守性。UBA7呈现BCL模式，在未刺激的埃及果蝠成纤维细胞中不可检测，IFN刺激后强烈诱导，而在人类成纤维细胞中组成性高表达且无显著诱导。CMPK2呈现HCL模式，在埃及果蝠细胞中组成性高表达，但在人类成纤维细胞中仅受IFN选择性诱导。ZBP1、ENPP4、MORC3和TOR3A均符合BIH分类，在埃及果蝠成纤维细胞中显著诱导而人类细胞中反应不显著。两种物种均诱导了保守的核心IFN反应，包括IFIT家族成员、MX蛋白、STAT1/2和ISG15等经典ISG。基因本体论分析显示，两种物种均显著富集抗病毒防御反应，但该富集在埃及果蝠细胞中更强。埃及果蝠成纤维细胞优先富集细胞内抗病毒防御和应激反应通路，而人类成纤维细胞相对更强地富集抗原呈递、细胞因子调节和更广泛的免疫调节程序。

1. 4.
   物种特异性细胞因子信号特征揭示埃及果蝠和人类成纤维细胞对不同刺激的分歧免疫策略

DAVID和gPROFILER通路富集分析显示，poly I:C刺激后，BCL基因簇富集于细胞因子信号通路（R-HSA-1280215，富集分数8.42），而HIH基因簇（CCL3、CCL20、CSF3、CXCL2、CXCL8、IL1A、IL1B）富集于白细胞介素-10信号通路（R-HSA-6783783，富集分数3.51）。IFNA刺激后，HCL基因簇1富集于IFN信号通路，基因簇2（CTSS、MYD88、PSMA2、PSMA6、PSMB2、PSMB3、PSMB9、PSME1、TAP1、TAP2）富集于抗原加工交叉呈递、吞噬体和蛋白酶体通路。HIH基因簇则显示IFN信号和细胞死亡通路的差异。这些结果共同表明，poly I:C刺激优先上调果蝠中的IFN相关基因，而人类成纤维细胞则以促炎细胞因子信号通路的强烈诱导为特征。

1. 5.
   干扰素ε在埃及果蝠免疫组织或刺激/感染成纤维细胞中无差异表达

研究人员检验了近期关于埃及果蝠呼吸和肠道类器官中IFNE组成性高表达驱动蝙蝠免疫韧性的观点。结果显示，埃及果蝠IFNE在大多数免疫组织（骨髓、外周血单核细胞、脾脏）中无显著表达，在脑、卵巢和肝脏中表达水平较高。人类组织中，脑和肝脏反而具有最高的IFNE组成性表达水平，这与Fung等报道的人IFNE在脑和肝脏中表达可忽略的结果不同。埃及果蝠IFNE的表达在MARV感染后无显著变化。IFNL1被鉴定为HIH基因，其诱导仅在暴露于MARV或poly I:C刺激的人类细胞中得到确认。

五、讨论与结论

研究人员提出了一个解释埃及果蝠在MARV感染中表现出强健但受控炎症反应的模型。该模型的关键组分包括CASP8、IFIH1、IRF1、IRF7、IRF9、MORC3、MX1、OAS3和ZBP1。OAS3介导病毒dsRNA感知并激活RNase L，可能促进下游RNA感知和IFN反应。MX1在基线水平高表达，通过靶向MARV核蛋白破坏病毒复制。ZBP1通过其Zα结构域识别MARV复制过程中产生的Z-RNA，并通过RHIM依赖性相互作用与RIPK1/RIPK3复合物互作，激活CASP3和CASP8驱动凋亡。MORC3作为IFN诱导的核支架，调节染色质结构和感染转录反应，在避免炎症放大的同时促进抗病毒防御。埃及果蝠数据集中未显示强烈的坏死性凋亡或焦亡特征，这与CASP8通过RIPK3相互作用抑制坏死性凋亡的已知功能以及蝙蝠炎症活性降低的研究一致。

与之形成鲜明对比的是，人类成纤维细胞的反应以炎症细胞因子和先天免疫放大因子的广泛激活为特征。人类细胞非选择性地上调CXCL8、FAS、IL6、RELA和TNF等炎症介质，并强效激活TLR2、TLR3和RIGI等模式识别受体。凋亡和坏死性凋亡通路组分（RIPK1、TNFSF10）也被上调，提示人类成纤维细胞的免疫激活可能同时促进组织损伤。这些特征共同表明，人类细胞虽能激活强效抗病毒程序，但缺乏特异性和约束性，这可能是MARV感染人类时过度炎症和病理损伤的基础。

研究结论指出，埃及果蝠与人类先天免疫系统的比较凸显了宿主免疫机制在塑造疾病结局中的关键作用。物种特异性抗病毒和炎症程序可能促成MARV感染结局的差异。该比较成纤维细胞系统为探索其他病毒-宿主相互作用提供了可操作的实验框架，同时挑战了蝙蝠免疫发现可跨蝙蝠物种或跨病毒感染泛化的观点。改进对不同蝙蝠对不同病毒反应的差异理解，对于评估和预测人兽共患溢出风险至关重要。

研究局限性包括：poly I:C转染效率差异可能部分解释观察到的转录差异；跨研究数据集整合可能混淆部分物种间表达差异；跨物种蛋白质组比较受序列差异和标准化约束限制；蝙蝠转录特征对MARV限制或耐受的功能贡献尚未直接验证。未来研究应调查与凋亡、核酸感知和IFN信号相关的抗病毒效应分子，以确定这些通路是否在限制过度免疫激活的同时促进MARV限制。