《Plants》：Identification and Characterization of the MAPK Genes in Sorghum and Their Expression in Response to Aphid Infestation
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促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联是调控植物生长发育及胁迫响应的关键信号组分。本研究通过综合生物信息学分析，包括序列比对、基因结构表征、保守基序分析及系统发育分析，共鉴定出19个高粱MAPK基因（SbMAPKs）。系统发育分析将SbMAPK家族划分为五个亚家
促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联是调控植物生长发育及胁迫响应的关键信号组分。本研究通过综合生物信息学分析，包括序列比对、基因结构表征、保守基序分析及系统发育分析，共鉴定出19个高粱MAPK基因（SbMAPKs）。系统发育分析将SbMAPK家族划分为五个亚家族（A–E）。进化分析表明，串联重复伴随强烈的纯化选择共同促进了SbMAPK基因家族在高粱中的扩张与保守。启动子分析揭示，多数SbMAPKs含有与植物激素信号传导及生物与非生物胁迫响应相关的预测顺式调控元件。此外，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析鉴定出9个SbMAPK基因在高粱蚜虫侵染后呈差异表达。其中，SbMAPK4在抗性基因型中持续表现出较高的表达水平，提示其可能在蚜虫诱导的防御响应中发挥作用。上述发现为功能表征提供了候选SbMAPK基因，并为MAPK基因家族的进化提供了新的见解，为阐明蚜虫抗性的分子机制奠定了基础，并支持高粱的遗传改良。
**研究背景与立题依据**
高粱（*Sorghum bicolor* (L.) Moench）是一种以耐旱性著称的C
4禾本科作物，兼具粮食、饲用和可再生生物燃料等多重用途，为世界第五大谷类作物。高粱蚜（原名甘蔗蚜，*Melanaphis sacchari* (Zehntner, 1897)）现已成为高粱种植区的重要害虫，可降低籽粒品质并造成30%至100%的显著产量损失。尽管已知若干品种具有蚜虫抗性，但其抗性分子机制尚不清楚。植物防御昆虫侵害依赖于对入侵昆虫的感知、反应及将信号转导为防御响应，而蛋白激酶在信号转导途径中至关重要。MAPK等信号分子是宿主植物与攻击性昆虫互作中最早响应的组分之一；当植食性昆虫攻击植物时，MAPKs发出信号并激活植物激素生物合成，进而改变下游基因表达以实现自我保护。尽管已有关于高粱MAPKKs和MAPKKKs的少量报道，但尚无高粱MAPKs的研究，尤其缺乏其对蚜虫侵染响应的研究，亦不清楚哪些SbMAPKs响应蚜虫取食、其响应在抗性与感病高粱基因型间是否存在差异。为此，研究人员重新鉴定了当前高粱基因组中的MAPK基因家族，并从系统发育、基因结构、保守基序、基因重复及与水稻和二穗短柄草的共线性等方面对其成员进行了表征，预测了SbMAPK启动子中的顺式调控元件和候选转录调控因子，并在蚜虫侵染转录组中检验了预测调控因子与SbMAPKs的共表达，最后通过qRT-PCR测定了抗性基因型Tx2783与感病基因型BTx623在蚜虫侵染期间的SbMAPK表达。
**主要关键技术方法**
研究人员采用两种互补策略鉴定高粱MAPK基因家族：以二穗短柄草MAPK蛋白序列对高粱基因组（v3.1.1）进行BLASTP搜索，并利用Pfam蛋白激酶结构域（PF00069）的隐马尔可夫模型（HMM）搜索蛋白组，经InterPro结构域分析确认；通过Clustal Omega多序列比对与MEGA 11最大似然法（Jones–Taylor–Thornton模型，1000次bootstrap）构建系统发育树；利用MEME Suite鉴定保守基序、WebLogo 3生成序列标识、GSDS绘制基因结构；采用MEGA 11基于密码子的Z检验计算dN/dS比值以分析基因重复与选择压力；通过PlantCARE分析启动子顺式元件、PTRM预测转录因子并用Cytoscape可视化调控网络、SWISS-MODEL进行同源建模；利用TBtools进行共线性分析。样本队列方面，选用抗性基因型Tx2783与感病基因型BTx623，蚜虫在感病品系Tx7000上饲养，于10–12日龄（2–3叶期）幼苗第一真叶正面接种20头无翅成蚜，于0、3、6、9天（dpi）取样，每处理三个生物学重复，以α-Tubulin（Sobic.001G107200）为内参基因进行qRT-PCR。
**研究结果**
2.1 高粱MAPK基因的鉴定：经BLAST搜索初步获得325条候选序列，经比对保守TXYxxTRWYRAPE基序及InterPro结构域分析，确认高粱基因组含19个MAPK基因；编码蛋白长度为275个氨基酸（SbMAPK3）至614个氨基酸（SbMAPK4），分子量为42.4至70.0 kDa，等电点为5.31至9.66，多数预测定位于细胞质。
2.2 系统发育关系与基序分析：基于六种植物MAPK蛋白及外群构建最大似然树，16个SbMAPKs聚为四个经典植物MAPK亚家族，A亚家族含SbMAPK3和SbMAPK17、B亚家族含SbMAPK2和SbMAPK11、C亚家族含SbMAPK8和SbMAPK18、D亚家族含10个成员；SbMAPK11与携带MEY基序的BdMAPK11聚在一起；SbMAPK1（TDY）、SbMAPK9（TEY）和SbMAPK16（TEY）未与任何植物MAPK亚家族聚类，而被归类为MAPK样蛋白。全部19个蛋白均含保守的TRWYRAPE和DFGLAR基序。
2.3 保守基序、染色体分布与基因结构：MEME鉴定出10个保守基序，基序8（TXYxxTRWYRAPE）存在于全部19个蛋白中；19个SbMAPK基因分布于7条染色体（Chr 2、6、8除外），外显子数目为2至16个、内含子数目为1至5个，基因结构变异支持系统发育树的聚类。
2.4 基因重复分析：鉴定出5对串联重复基因（SbMAPK4-SbMAPK5、SbMAPK7-SbMAPK8、SbMAPK13-SbMAPK14、SbMAPK16-SbMAPK17、SbMAPK6-SbMAPK9），各对dN/dS比值均小于1且具显著性，表明经历了强烈的纯化选择。
2.5 顺式元件、同源建模与共线性分析：全部19个SbMAPK基因均含激素响应元件（如ABRE及JA响应元件TGACG-motif和CGTXA-motif），并含生物与非生物胁迫响应元件；PTRM预测识别出ERF、MIKC_MADS、NAC、WRKY和LBD五个转录因子家族参与调控，其中NAC家族最为丰富；同源建模显示各亚家族内蛋白结构相似，所有SbMAPKs均含N端甲硫氨酸和蛋白激酶（PK）结构域，TEY型激酶含CD结构域而TDY型激酶缺乏该结构域但具富含Ser/Thr的C端序列；共线性分析显示更多SbMAPK基因与水稻近缘。
2.6 蚜虫侵染下SbMAPK基因的表达分析：9个SbMAPK基因呈差异表达，其中7个在抗性基因型Tx2783中表达较高（SbMAPK13和SbMAPK14除外）；SbMAPK3和SbMAPK5在侵染后9天（dpi）上调约7倍，SbMAPK1呈早期响应，其余8个基因呈延迟响应；不同时间点的上调与下调模式反映了植物与蚜虫间动态互作及持续的调控调整。
**讨论与结论**
讨论部分指出，全部19个SbMAPK基因均具保守MAPK特征基序，其TXY基序数量与拟南芥、二穗短柄草、水稻、小麦、茶树和毛果杨一致；基因结构分析显示A、B亚家族及部分C亚家族成员共享相似外显子–内含子结构，而D亚家族变异较大；系统发育分析将19个SbMAPKs聚为五个亚家族，D亚家族最大且最多样，其扩张提示谱系特异性分化。基因重复分析表明纯化选择主导SbMAPK家族进化，重复基因可能保留祖先功能从而参与多种生物与非生物胁迫响应。启动子分析鉴定的激素与胁迫响应顺式元件及MYB结合元件，与草莓、棉花和猕猴桃中的研究一致。预测的NAC等转录因子家族参与防御调控，但需实验验证直接的TF–启动子互作。蛋白三维结构分析支持N端PK结构域的保守性，而激活环基序变异可能反映进化分化与功能特化。表达分析鉴定出候选SbMAPKs，但尚不能直接确立其在蚜虫抗性中的作用；SbMAPK3和SbMAPK17分别与拟南芥AtMAPK3和AtMAPK6直系同源，比较分析为SbMAPK功能假设提供了框架，但功能保守性需实验验证。研究同时指出其证据为相关性，需基因沉默、基因编辑或过表达结合蚜虫生物测定等功能研究加以验证，顺式元件、转录因子及蛋白结构分析均为计算预测，且未研究可变剪接与组织特异性表达。
结论部分译文：总之，研究人员在高粱中鉴定出19个MAPK基因和3个MAPK样基因，并表征了其系统发育关系、基因结构、进化模式及预测的调控特征。重复的SbMAPK基因在纯化选择下得以保留，其启动子含有与植物激素信号传导和胁迫响应相关的预测顺式调控元件。高粱蚜侵染后，9个SbMAPKs表现出基因型和时相依赖的表达模式。值得注意的是，SbMAPK3、SbMAPK4和SbMAPK5主要在抗性基因型Tx2783的后期被诱导，而其他若干基因在感病基因型BTx623中响应较早。这些发现为深入研究其在蚜虫抗性中的作用提供了候选基因。未来研究应聚焦于：（i）通过基因沉默或过表达结合蚜虫生物测定对这些候选基因进行功能验证；（ii）确定蚜虫侵染后MAPK蛋白激活在抗性与感病基因型间是否存在差异；（iii）实验验证预测的顺式调控元件和转录调控因子。若其对蚜虫抗性的贡献得到证实，这些基因可为分子标记开发和基因组编辑提供有价值的靶标，从而支持抗蚜高粱育种。
