面包冬小麦丝氨酸乙酰转移酶2（sat2）单倍型与多环境因子对籽粒蛋白质含量及产量相关性状的影响

《Plants》：Effects of Serine Acetyltransferase 2 (sat2) Haplotypes and Multiple Environmental Factors on Grain Protein Content and Yield-Related Traits in Bread Winter Wheat

丝氨酸乙酰转移酶2（serine acetyltransferase 2, sat2）是半胱氨酸生物合成的限速酶，也是硬粒小麦籽粒蛋白质含量的候选基因。本研究检验了其基因内变异是否与面包冬小麦的蛋白质含量相关，以及该效应如何受年份、作物管理措施、品种起源及其他位点的影响。研究人员利用竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive Allele-Specific PCR, KASP）对65个品种进行了TDsat2.e9.1（G>A, Gly325Ser）和TDsat2.i1.1（G>T, 内含子1）的基因分型。两个变异完全连锁：仅存在Hap1（G; T; 32个品种）和Hap2（A; G; 33个品种；中国春参考单倍型）。对5913个观测值（2021–2025年；同一地点16个年份×管理环境组合）采用线性混合模型进行分析，以品种为重复单位。Hap1的蛋白质含量比Hap2高0.58%（95%置信区间0.22–0.93；p = 0.0017；q = 0.014）；该效应在以籽粒产量为协变量以及校正Glu-A1、Glu-D1和1BL.1RS后依然存在，且单倍型频率与品种起源和Rht-B1无关。独立测量的性状（包括籽粒产量）无显著差异。该效应在所有年份中方向一致但大小不同（p = 0.0013）；未检测到与作物管理措施的交互作用。该关联需在其他种质集合中进行验证。

论文解读文章

研究背景与科学问题

面包小麦（Triticum aestivum L.）是全球主要的粮食作物之一，也是欧亚人群植物蛋白的主要来源。籽粒蛋白质含量是决定小麦加工品质和营养品质的关键指标。面筋（gluten）是由谷蛋白（glutenin）和醇溶蛋白（gliadin）组成的不溶性复合体，其中高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）构成其结构骨架。除了这些结构基因外，多种调控因子也影响籽粒品质：NAC转录因子Gpc可加速衰老和氮素向籽粒的再转运；矮化基因Rht改变氮素在籽粒与生物量间的分配；1BL.1RS易位虽能增强抗病性却可能降低烘焙品质；光周期敏感基因则改变籽粒灌浆的时间节点。此外，年度天气条件对籽粒品质的影响程度可与基因型相媲美。

硫素供应通过一条独立的途径作用于籽粒品质。半胱氨酸主要存在于谷蛋白中，其形成的分子间二硫键决定了面筋网络的弹性。因此，半胱氨酸生物合成相关基因既是蛋白质含量的候选基因，也是面筋品质的候选基因。sat2基因编码丝氨酸乙酰转移酶，催化O-乙酰丝氨酸的形成——这是半胱氨酸生物合成的限速步骤。在硬粒小麦中，一项基于全基因组关联研究（GWAS）在190份材料中鉴定出染色体4B上的一个位点，sat2被提出为该位点的候选基因；对该基因进行测序后发现两个多态性位点：外显子9中的错义变异Gly325Ser在重组自交系（RIL）中与蛋白质含量增加1.33%相关（p = 0.003），内含子1变异在一个包含230份材料的关联群体中与增加0.92%相关（p = 0.003），并针对这两个位点开发了KASP标记。面包小麦同源基因的表达在开花后20–30天的糊粉层和亚糊粉层达到峰值，恰逢贮藏蛋白积累期。

然而，该位点在面包小麦中尚未得到验证。研究人员假设，在硬粒小麦中与较高蛋白质含量相关的sat2单倍型在面包冬小麦中具有相同的效应方向。本研究的目的是：（i）评估该单倍型在五个收获年份的16个年份×管理环境组合中对蛋白质含量及另外十一个性状的影响；（ii）检验该效应是否依赖于收获年份和作物管理水平；（iii）检验该关联是否可由品种起源、Rht-B1、谷蛋白位点Glu-A1和Glu-D1、1BL.1RS易位或产量稀释效应所解释；（iv）定位外显子替换在预测的SAT2蛋白质结构中的位置。

主要关键技术方法

研究人员对一个由65个注册品种和高级育种品系组成的种质资源库进行了分析，这些材料由Shchelkovo Agrokhim JSC公司为育种目的保存，并非为本研究专门构建。采用竞争性等位基因特异性PCR（KASP-PCR）技术对两个sat2基因内多态性位点（TDsat2.e9.1和TDsat2.i1.1）进行基因分型。田间试验在俄罗斯奥廖尔州（Oryol Oblast）的一个地点进行，涵盖2021至2025年共五个收获年份，设置了三种（T1传统、T2优化决策、T3最大潜力）或四种（2021年增设T4集成方案）作物管理水平，形成16个环境组合。统计分析采用线性混合模型，以品种为遗传效应的重复单位，通过Kenward-Roger近似计算自由度，并使用Benjamini-Hochberg方法分别对近红外（NIR）衍生指数家族和独立测量性状家族进行多重比较校正。

研究结果

2.1 sat2与籽粒蛋白质含量的关联

在全数据集（5913个观测值，65个品种，同一地点16个年份×管理环境组合）中，Hap1的蛋白质含量比Hap2高0.576%（标准误0.176，95%置信区间0.22–0.93，df = 61.8，p = 0.0017）；经NIR衍生指数家族（八个性状）的多重比较校正后，q = 0.0139。湿面筋含量（+1.150%，q = 0.0296）和Zeleny沉降值（+5.06 mL，q = 0.0296）表现出相同方向的差异。独立于NIR分析的性状均无显著差异：籽粒产量?1.76 dt/ha（p = 0.284），千粒重+1.16 g（p = 0.155），容重?0.56 g/L（p = 0.856），降落数值+15.0 s（p = 0.355）；四个性状的q值均≥0.47。其余NIR衍生指数也无显著差异（p = 0.16–0.42）。两个标记在65个品种中完全一致（D' = 1，r2 = 1），因此Hap1和Hap2与各标记的两个等位基因重合。该位点解释了品种间蛋白质含量方差的14.2%（组内相关系数为0.64时）；对籽粒产量的贡献可忽略不计（0.2%）。

2.2 湿面筋和Zeleny沉降值由同一光谱计算得出

湿面筋含量和Zeleny沉降值并非独立测量：分析仪从与蛋白质含量相同的近红外光谱中计算得出。湿面筋含量对蛋白质含量的年内决定系数（R2）为0.83–0.98，回归斜率随年份从1.80变化至2.83；Zeleny沉降值的R2在2021年为0.87，2022年为0.89。两个单倍型在这些指数上的差异因此源自蛋白质含量的差异。

2.3 效应大小取决于年份

该效应在所有五个年份中方向一致但幅度不同：sat2×年份交互作用对蛋白质含量显著（F = 4.52，p = 0.0013；十二个性状校正后q = 0.016）。效应在2021年最大（+0.937%，p = 0.0015），该年份的试验平均蛋白质含量最高（15.9%）且降水量最低。其他年份的估计值为+0.492%（2022）、+0.323%（2023）、+0.430%（2024）和+0.490%（2025，p = 0.023）。淀粉含量（p = 0.0041；q = 0.024）和籽粒产量（p = 0.0096；q = 0.038）的sat2×年份交互作用也通过了多重比较校正，但这两个性状均无单倍型主效应，表明这些交互作用反映了估计值围绕零的年际波动。

2.4 未检测到与作物管理水平的交互作用

未检测到单倍型与作物管理水平之间的交互作用。在五个收获年份均应用的三个水平（T1–T3；15个环境）下，蛋白质含量的p = 0.283，湿面筋含量p = 0.152，Zeleny沉降值p = 0.823，籽粒产量p = 0.867；所有与管理水平的交互作用均未通过多重比较校正（q ≥ 0.75）。各水平内的简单效应估计显示：T1下蛋白质含量+0.55%（95%置信区间0.18–0.92），T2下+0.49%（0.12–0.86），T3下+0.66%（0.29–1.03）；T3与T1之差为+0.11%（95%置信区间?0.10至+0.33；最小可检测差值为0.30%）。在仅2021年应用的T4水平下，效应为+0.84%（0.25–1.43）。数据表明，极端水平间单倍型效应的差异上限约为蛋白质含量的0.3%。

2.5 品种起源及谷蛋白和1BL.1RS位点

单倍型频率与记录的起源组无关（χ2 = 4.28，df = 2，置换检验p = 0.133），也与育种中心无关（置换检验p = 0.54）；将起源作为协变量后估计值不变（+0.569%，p = 0.0037）。探索性比较显示，中央区育种品种的效应较大（+0.944%，p = 0.00052，23个品种），而南方育种品种的效应较小（+0.419%，p = 0.19，26个品种；最小可检测效应0.86%）；sat2×起源交互作用不显著（F = 2.10，p = 0.15）。在育种中心内部，Shchelkovo Agrokhim品种（13个品种，+0.881%，p = 0.0016）和ANC Donskoy品种（14个品种，+1.016%，p = 0.027）效应显著，而Lukyanenko中心品种（12个品种，?0.188%，p = 0.65）无效应；这些子样本较小，比较属于探索性质。

将三个额外品质位点作为协变量加入模型：Glu-A1（三个等位基因，47个品种有明确分型）、Glu-D1（两个等位基因，45个品种）和1BL.1RS易位（55个品种）；Glu-B1近乎单态（48个品种中46个相同），Gpc-B1未进行基因分型。单倍型频率与这些位点无关（Fisher精确检验p = 0.08–0.88）。在各位点分型的品种中，蛋白质效应从+0.86%变为加入Glu-A1后的+0.71%（p = 0.0014），从+0.79%变为加入Glu-D1后的+0.76%（p = 0.0011），从+0.70%变为加入1BL.1RS后的+0.69%（p = 0.0010）；同时加入三个协变量后，效应从+0.84%变为+0.71%（42个品种，p = 0.0039）。部分效应因此与Glu-A1共享，因为其无效等位基因在Hap2品种中更常见（33个中6个，对比32个中1个）。

2.6 Rht-B1和籽粒产量作为协变量

Rht-B1对60个品种进行了分型（27个携带矮化等位基因Rht-B1b或Rht-B1e，33个为野生型Rht-B1a）；其等位状态与sat2单倍型独立分布（χ2 = 0.000，置换检验p = 1.00）。在两个位点均有分型的59个品种中，不加协变量时效应为+0.491%（p = 0.0074），加入协变量后为+0.490%（p = 0.0079），且未检测到sat2×Rht-B1交互作用（蛋白质含量p = 0.45）。以籽粒产量为线性协变量时，Hap1的效应持续存在：+0.534%（标准误0.155，p = 0.0010）；产量系数为每dt/ha ?0.022%蛋白质，表明数据中存在稀释效应。Hap1的优势因此在同等产量水平下得以保持。

2.7 Gly325Ser取代的结构背景

该取代位于面包小麦B亚基因组sat2同源基因（UniProt A0A3B6IYA1，基因TraesCS4B02G330300，338个残基）AlphaFold数据库模型的末端螺旋（残基317–326）C端边缘，距离C末端13个残基，位于预测可信度较低的区域（残基325处pLDDT≈50；后续无序片段30–46）。催化核心（残基61–313）预测可信度高（pLDDT>70），在两个等位状态的模型中Cα原子偏差不超过0.16?，因此未预测到对核心的影响。在模型中，Ser325的侧链被预测与Glu321和His322的羰基形成氢键，封住螺旋最后一圈；甘氨酸无法形成这种封盖，使后续片段保持流动性。植物丝氨酸乙酰转移酶的C末端区域参与与O-乙酰丝氨酸（硫醇）裂解酶（OASTL）形成半胱氨酸合酶复合物，因此其流动性的改变可能改变复合物组装平衡和发育籽粒的半胱氨酸供应；这仍是一个需要测量两种等位形式的酶活性和复合物形成的假说。在19个同源性超过70%的禾本科直系同源序列中，位置325在五个序列中为甘氨酸，两个序列中为丝氨酸；在黍亚科禾草中，其C末端序列不同，该位置为疏水性残基。该位置并非严格保守，这与效应的中等幅度相符。

讨论与结论

这是首次证明在硬粒小麦中被描述为蛋白质含量候选基因的sat2多态性与面包冬小麦的籽粒蛋白质含量相关。Hap1（TDsat2.e9.1位点为G，即Gly325；TDsat2.i1.1位点为T）在五个收获年份的16个年份×管理环境组合中，蛋白质含量比Hap2（中国春参考基因组的单倍型，A；G）高0.58%。方向与硬粒小麦一致，其中较高的蛋白质含量与外显子9的核苷酸G相关。单倍型频率与记录的品种起源和Rht-B1无关，该效应在校正Glu-A1、Glu-D1、1BL.1RS和籽粒产量后仍然存在，且在研究的统计效力范围内未检测到与作物管理水平的交互作用。

这些标记并非匿名标签。两个多态性均位于染色体4B的sat2基因内部，属于B亚基因组——硬粒小麦（AABB）和面包小麦（AABBDD）共有，因此它们分型的是同一个同源基因。外显子变异的效应在硬粒小麦的重组自交系中得到确认（实验设计排除了群体结构），而内含子变异仅依赖关联证据。结合Gly325Ser位于酶调控性C末端区域的事实，这提供了一个合理的功能假说，但并非因果关系的证明。面包小麦中较小的效应（+0.58%对比硬粒小麦的+0.92–1.33%）可能反映了同源冗余——面包小麦在D亚基因组携带第三个基因拷贝——以及俄罗斯冬小麦品种不同的遗传背景。

该效应在所有五年中方向一致，但在2021年——试验平均蛋白质含量最高的年份——约增大一倍。硫利用效率的差异可能在蛋白质积累不受其他因素限制时变得可见；由于仅有五个收获年份且天气变量共同变化，这无法在此检验，需要在控制硫供应的试验中进行。

对于育种而言，该单倍型可在任何年份作为额外的选择标准，在亲本选择和早期世代品系筛选中最为有用。在有利于蛋白质积累的条件下增益可能更大，但将选择局限于此类环境并不合理，因为管理水平间的差异据数据仅限于约±0.3%。这类单一位点标记补充而非替代基因组预测和其他数据驱动的作物育种方法；具有确认效应的位点（如sat2单倍型）可作为固定协变量进入基因组预测模型，这也将在更广泛的种质中检验其贡献。由于在一个育种中心的品种中未检测到效应，在将标记应用于其材料前应在各自育种计划内检查该关联。

sat2单倍型是否通过半胱氨酸对二硫键形成的可用性直接影响面筋品质本身仍有待解答：在本研究中，湿面筋含量和Zeleny沉降值由与蛋白质含量相同的光谱计算得出，该问题需要面筋洗涤、流变学测试和籽粒半胱氨酸含量测定。

研究结论

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  Hap1（TDsat2.e9.1位点为G，即Gly325；TDsat2.i1.1位点为T）的籽粒蛋白质含量比Hap2（A；G，中国春参考基因组的单倍型）高0.58%（95%置信区间0.22–0.93；p = 0.0017；q = 0.014），数据来自同一地点五个收获年份的16个年份×管理环境组合。这是在普通小麦（Triticum aestivum L.）中首次发现该关联，其方向与硬粒小麦一致。
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  该效应不能由产量稀释、Rht-B1或记录的品种起源解释，在校正Glu-A1、Glu-D1和1BL.1RS易位后仍然存在（+0.71%）；籽粒产量及其他独立测量性状在单倍型间无差异。
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  该效应在所有五年中方向一致，但在最有利于蛋白质积累的年份最大。在五个收获年份的T1–T3水平间未检测到单倍型×作物管理交互作用；数据显示极端水平间的差异限于约±0.3%蛋白质含量。
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  Gly325Ser取代位于SAT2的调控性C末端区域，为该关联提供了合理的功能假说。在将该标记推荐用于该基因库之外的标记辅助选择之前，需要在不同起源和遗传背景的种质集合中进行验证。