大蒜（*Allium sativum*）提取物与拮抗真菌对小麦稻瘟病（Wheat blast）的可持续防控潜力及其防御相关基因表达调控

《Plants》：Botanical Extracts and Antagonistic Fungi for the Sustainable Management of Wheat Blast Caused by Pyricularia oryzae Triticum Pathotype

小麦稻瘟病由*Pyricularia oryzae* Triticum pathotype（PoT）引起，对小麦生产构成重大威胁，凸显了对常规杀菌剂可持续替代方案的需求。本研究在离体（in vitro）和活体（in vivo）条件下评价了*Lippia alba*与*Allium sativum*植物提取物以及拮抗真菌*Trichoderma harzianum*和*Epicoccum nigrum*对PoT的抗真菌、生长相关及病害抑制效应。在双培养（dual-culture）和毒化培养基（poisoned-food）试验中，*A. sativum*提取物（5 mL）和*T. harzianum*（TH-FCCT-1155-4）强烈抑制PoT，完全抑制分生孢子形成（conidiation），菌丝生长（mycelial growth）分别降低90%以上和58%。以*A. sativum*、*T. harzianum*和*E. nigrum*进行种子处理无药害（non-phytotoxic），并与PoT侵染幼苗的多个幼苗生长参数（包括叶片数、茎粗和干生物量）较高值相关，同时降低种子至幼苗的病害传播。在苗期（GS 1.5）和抽穗期（GS 6.0）进行叶面喷施可降低多个品种–菌株组合的病害发展，但处理响应因PoT菌株和小麦品种而异。在抽穗期，处理对穗部病害严重度和千粒重（thousand-grain weight，TGW）的影响也因品种–菌株组合而异。相反，*L. alba*在1000 ppm时表现出药害效应，且在抽穗期施用不能持续降低穗部病害严重度。RT-qPCR分析表明，大蒜种子处理与接种后48至72 h特定采样时间点防御相关基因*PR5*和*APX*转录丰度较高相关。总体而言，这些结果确定*A. sativum*、*T. harzianum*和*E. nigrum*为进一步在标准化温室和田间研究中评价小麦稻瘟病管理的候选物，并为其效应可能涉及直接抗真菌活性以及（就*A. sativum*而言）调节寄主防御反应提供了证据。

小麦稻瘟病是由*Pyricularia oryzae* Triticum pathotype（PoT）引起的毁灭性病害，严重威胁小麦生产且难以防控。当前防控策略主要依赖合成杀菌剂，但其效果不稳定，且 intensive 使用带来环境与健康风险。因此，需要将抗性品种与化学及辅助防控措施相结合的综合管理策略。然而，有效抗源仍然有限，尽管2NS/2AS易位与抗性增强相关，但其表达受小麦遗传背景和病原菌株影响。三唑类杀菌剂及其混剂虽对PoT有效，但可持续且互补的病害管理策略仍显必要。基于植物源化合物和有益微生物的生物合理（biorational）途径是有前景的替代或补充手段，其潜力不仅限于直接抑制病原，还可能涉及抗生作用（antibiosis）、竞争（competition）、重寄生（mycoparasitism）以及激活植物防御反应，部分微生物还可促进植物生长。植物提取物因含有多种生物活性化合物而备受关注。*Lippia alba*先前已显示对PoT的抑制活性，大蒜（*Allium sativum*）提取物及其生物活性化合物对多种谷物病原（包括与稻瘟病相关的*Magnaporthe*/*Pyricularia* spp.）表现出抗真菌效应。近期研究表明，大蒜提取物在离体条件下可抑制*M. oryzae* Triticum pathotype菌丝生长，尽管其抑制效果随时间下降。这些发现支持在种子和叶面施用条件下进一步评价植物源产品。有益真菌也提供互补的病害抑制机制。*Trichoderma* spp.是研究最广泛的生物防治真菌之一，可通过竞争、抗生、重寄生和诱导植物防御发挥作用，同时促进植物生长。其在离体和温室条件下对小麦稻瘟病的潜力已有报道，包括直接拮抗和重寄生的证据。腐生真菌*Epicoccum nigrum*同样在水稻稻瘟病上显示出生物防治和促生长效应，但其在小麦–PoT病理系统（pathosystem）中的潜力尚不清楚。因此，评价具有不同生态和功能特征的互补真菌拮抗物可能扩展小麦稻瘟病管理的生物工具范围。生物防治剂与植物防御系统之间的互作是另一值得关注的机制。*P. oryzae*侵染可诱导活性氧（reactive oxygen species，ROS）代谢和防御相关基因表达的变化，而*Trichoderma*介导的保护与病程相关（pathogenesis-related）响应、苯丙烷代谢（phenylpropanoid metabolism）和脂质信号（lipid signaling）相关基因的调控有关。在小麦–PoT病理系统中，防御相关基因表达也随寄主感病性而异，*PR-1*转录积累的时序和持续性差异与病害发展相关。这些观察提示，植物源和微生物处理可能不仅通过直接作用于病原，还通过增强或 priming 寄主防御反应来抑制小麦稻瘟病。然而，植物提取物和拮抗真菌对病原抑制、小麦生长、病害发展及防御相关基因表达的综合效应尚未在小麦–PoT病理系统中得到全面评价。因此，本研究旨在利用互补的离体和活体试验，评价*Lippia alba*和*Allium sativum*提取物以及拮抗真菌*Trichoderma harzianum*和*Epicoccum nigrum*对PoT的抗真菌和植物有益效应。具体而言，研究人员评估了其对病原生长和分生孢子形成、种子和幼苗健康、植物生长和活力、种子和叶面施用后的病害发展，以及针对最有效处理的小麦幼苗中选定防御相关基因表达的影响。这一整合方法用于鉴定候选植物源和微生物处理，以便进一步评价其在 wheat blast 管理中的潜力，并为病害抑制的潜在机制提供见解。

在离体试验中，所有浓度的*L. alba*提取物均显著降低所有PoT菌株的径向生长速率（p < 0.001）。最强效应在1000 ppm观察到，尤其对PY74和PY07；PY74在500 ppm时也受到强烈抑制。菌丝生长抑制率（mycelial growth inhibition，MGI）随提取物浓度增加而升高，1000 ppm时对PY74和PY07分别达90.24%和72.31%，500 ppm时对PY74达64.86%。大蒜提取物在所有测试浓度下均显著降低所有PoT菌株的营养生长；3和5 mL处理对所有菌株的MGI均超过90%（PY15在3 mL时为56%除外），且完全抑制分生孢子产生，表明对病原繁殖有强烈影响。双培养试验中，两株*T. harzianum*均显著降低10个PoT菌株的径向生长速率；TH-FCCT-1155-4的MGI最高，对PY07（57.00%）、PY22（56.97%）和PY82（58.35%）超过50%，而TH-FCCT-63均低于50%，对PY02最高为46.43%。两株*T. harzianum*均完全抑制PoT产孢，同时在不同程度上降低菌丝生长。双培养中观察到*T. harzianum*与PoT之间的直接菌丝互作，拮抗菌对基质的快速占据可能 contributed to 观察到的抑制。两株*E. nigrum*均影响PoT菌丝生长和分生孢子产生，但响应幅度和方向因病原菌株而异。EPICC-02对菌丝生长的降低最强，MGI为30.0%–68.9%，对PY02抑制最高（68.9%）；EPICC-01活性较弱，对所有PoT菌株MGI均低于50%，对PY82抑制最高（49.23%）。对分生孢子产生的影响具菌株依赖性：EPICC-01和/或EPICC-02处理后，多个PoT菌株的分生孢子产生显著增加，而PY03显著降低，其他一些组合与未处理对照无显著差异。双培养中未观察到可见抑制带，提示对基质的竞争可能 contributed to 观察到的拮抗效应。

在活体试验中，1000 ppm *L. alba*提取物显著降低两个小麦品种的种子发芽率，并诱导严重的幼苗矮化和畸形；5%（v/v）丙二醇（propylene glycol）溶剂对照在所评价条件下未引起药害。基于此，*L. alba*后续以500 ppm评价。在两个小麦品种中，*T. harzianum* TH-FCCT-1155-4、*E. nigrum* EPICC-02和大蒜提取物种子处理与接种未处理对照相比，多个幼苗生长参数（尤其叶片数、茎粗、总长度和干生物量）值较高；大蒜提取物与较高生物量及多个组合中较长纵向生长相关。相反，*L. alba*对幼苗生长影响有限，但显著提高cv.‘MS INTA 215’的绿度指数（greenness index）。这些响应的幅度因PoT菌株和小麦品种而异。在两个品种的多个处理–菌株组合中，叶面病害严重度低于接种未处理对照，但响应的幅度和统计显著性因PoT菌株而异。在cv.‘Buck Aparcero’中，大蒜提取物和EPICC-02最一致地降低病害严重度，而*L. alba*尽管对植物生长影响有限，但对PY34和PY82表现出特别强的效力；在cv.‘MS INTA 215’中，TH-FCCT-1155-4、EPICC-02和大蒜提取物总体提供最强的病害降低，TH-FCCT-1155-4对PY82效应最大，而*L. alba*对该品种PY22效力有限。种子处理对后续叶部病害发展的影响因PoT菌株而异。对于PY15挑战，种子处理的总体效应未达统计显著（ANOVA，F = 5.58，p = 0.0622），但大蒜提取物（5 mL）平均病害严重度最低（6.2%），其次为TH-FCCT-1155-4（11.8%）、*Lippia* 500 ppm（16.0%）和EPICC-02（18.8%），对照为38.4%。对于PY34，种子处理对病害严重度有显著效应（ANOVA，F = 97.60，p = 0.0003）；TH-FCCT-1155-4、*Lippia* 500 ppm和大蒜提取物病害严重度最低（分别为10.5%、13.0%和13.5%），彼此无显著差异；EPICC-02为中等（25.5%），对照最高（51.5%）。病斑密度呈相似模式：PY15所有处理植株病斑密度显著低于对照（0.92–1.28 lesions cm^?2 vs. 2.55 lesions cm^?2；F = 18.66，p = 0.0075）；PY34所有处理也显著降低病斑密度（0.67–1.76 lesions cm^?2 vs. 3.57 lesions cm^?2；F = 80.64，p = 0.0004），TH-FCCT-1155-4最低（0.67 lesions cm^?2）。这些结果表明预防性种子处理降低了后续叶面接种后PoT病斑的发展，但其对总体病害严重度的效应因病原菌株而异。苗期叶面喷施的接种后效力因品种和PoT菌株而异。在cv.‘Buck Aparcero’中，TH-FCCT-1155-4对PY02响应最强，显著降低AUDPC（18.2 vs. 对照175.7），并将症状限制为抗性型互作特征的小型非扩展病斑；EPICC-02、大蒜提取物和*L. alba*也降低病害，*L. alba*对PY15效力特别强（AUDPC：38.75）；对PY22所有处理均显著降低AUDPC，大蒜提取物对PY34和PY82值最低。在cv.‘MS INTA 215’中观察到相似模式，TH-FCCT-1155-4、大蒜提取物和*L. alba*对PY02特别有效，所有处理均降低PY15和PY22的病害进展，EPICC-02对PY34和PY82的AUDPC最低。抽穗期（GS 6.0）接种后叶面施用提供的保护因品种和PoT菌株而异。在cv.‘Buck Aparcero’中，TH-FCCT-1155-4、大蒜提取物和EPICC-02在多个菌株–处理组合中降低穗部病害严重度并与较高TGW相关；TH-FCCT-1155-4在多个组合中降低穗部严重度并提高TGW，大蒜提取物对PY15和PY82效应强；*L. alba*响应更多变。Cv.‘MS INTA 215’对小麦稻瘟病更感病，处理效力在病原菌株间变异更强；TH-FCCT-1155-4、大蒜提取物和EPICC-02在多个组合中降低穗部严重度并与较高TGW相关。总体而言，抽穗期接种后叶面施用降低了多个病原–品种组合的穗部稻瘟病严重度并与TGW差异相关，但处理响应因PoT菌株和小麦品种而异。RT-qPCR分析表明，在PoT PY15–cv.‘MS INTA 215’病理系统中，大蒜处理的幼苗在特定采样时间点*PR5*和*APX*转录丰度高于相应未处理对照，而*WCI-2*和*POX-2*在所评价采样时间点无显著差异，表明大蒜处理与小麦–PoT互作期间选定防御和氧化胁迫相关基因表达的差异相关。

讨论部分指出，本研究提供证据表明植物提取物和真菌拮抗物可通过影响病原生长和繁殖抑制PoT，并在植物水平观察到额外的处理相关响应；机制因处理而异，现有证据支持植物提取物的直接抗真菌活性和*T. harzianum*的直接拮抗互作，而植物介导响应的贡献针对*A. sativum*通过防御相关基因表达进行了探索。*L. alba*的抗真菌活性与先前报道一致，抑制随浓度增加提示浓度依赖效应，但实验无法鉴定具体细胞或生化靶点；1000 ppm的药害表明其抗真菌活性须与浓度依赖的寄主效应一并考虑；500 ppm时*L. alba*对植物生长影响可变但种子处理后降低病害发展；抽穗期施用效力可变可能受制剂溶剂影响，因*L. alba*制剂含5%（v/v）丙二醇且穗部病害评价未设溶剂对照，故不能将病害响应完全归因于植物提取物；据研究人员所知，本研究首次提供*L. alba*在活体条件下用于小麦PoT的证据。大蒜提取物在植物源处理中显示强抗真菌活性，其离体完全抑制PoT生长与先前报道一致，可能与含硫化合物（包括大蒜素allicin及相关有机硫代谢物）有关；离体完全抑制分生孢子形成进一步提示大蒜处理可能干扰病原繁殖发育，但未鉴定具体细胞靶点或生化途径；无可见药害与水稻中先前观察一致；本研究通过证明大蒜在活体条件下对小麦PoT的效力扩展了这些发现，种子和叶面施用降低多个品种–菌株组合的病害发展，大蒜处理植株多个生长参数值高于接种对照；然而，因未纳入处理未接种植株，设计无法区分大蒜对植物生长的直接效应与病害减轻相关的生长响应。*T. harzianum*的活性似乎涉及与PoT的直接拮抗互作；双培养中观察到直接菌丝互作，拮抗菌更快速占据基质可能 contributed to 病原生长抑制；营养和空间竞争及抗真菌代谢物产生是*Trichoderma*介导拮抗的常见机制，但本研究未评价具体代谢物和细胞互作，这些机制应视为可能贡献而非已证明的作用模式。与先前研究一致，*T. harzianum*在多个实验组合中显示病害抑制效应并与特定组合中较高植物生物量和TGW相关，但这些响应可能符合先前报道的*Trichoderma*介导病害抑制机制，包括营养和空间竞争、抗生和植物介导效应；然而本研究未直接评价这些机制，且缺乏处理未接种植株，无法区分病害抑制相关效应与对植物生长的直接效应；响应幅度也因PoT菌株和小麦品种而异，需标准化条件下进一步实验确定可重复性和机制。*E. nigrum*也显示有前景的生物防治活性，但其在小麦稻瘟病中的作用研究较少；离体降低PoT生长和种子处理后病害抑制与水稻中先前发现一致；本研究中无可见抑制带结合PoT菌丝生长降低，与空间或营养竞争在观察到的拮抗效应中可能发挥作用相兼容，但其他机制（包括可扩散或挥发性抑制化合物产生）未直接评价；此外，*E. nigrum*对PoT繁殖发育的影响具菌株依赖性：尽管菌丝生长降低，多个PoT菌株分生孢子产生显著增加，而PY03显著降低，其他一些组合与对照无显著差异；分生孢子产生增加可能构成潜在流行病学隐患，因为分生孢子是稻瘟病重要二次侵染源，但这些观察来自离体条件，其对田间分生孢子扩散、侵染和病害发展的意义仍不确定；多个生长相关参数改善、病害发展降低和特定组合较高TGW进一步支持*E. nigrum*的病害抑制潜力，但这些响应应结合其对病原繁殖的菌株依赖效应解读；因未直接评价 underlying mechanisms，需进一步研究确定可重复性、菌株依赖性和*E. nigrum*在小麦中活性的贡献机制。预防性种子处理实验因独立实验单元数量有限应视为初步和探索性，观察到的处理效应应谨慎解读并在更大重复实验中确认。抽穗期实验的局限是未纳入未接种对照，因此TGW差异应相对于接种未处理对照解读，而非作为恢复至健康植株水平或保持总产量的证据。本研究更广泛的局限是所有实验均在受控离体或温室条件下进行，使用培养皿、卷纸试验、多孔盘或盆钵；尽管这些实验系统允许受控评价处理响应，但不能重现田间的环境变异和流行病学条件；此外，未纳入注册杀菌剂作为参考处理，制剂稳定性、货架期、残留活性、拮抗菌在植物上的持久性或定殖以及田间效力均未评价；因此，本研究结果为选择有前景的候选处理提供初步证据，以便进一步标准化温室和田间研究评价其在小麦稻瘟病管理程序中的潜在应用。寄主防御反应分析提供额外证据表明大蒜处理可能超越直接病原抑制发挥作用；在感病‘MS INTA 215’–PY15互作中，大蒜种子处理与特定时间点*PR5*和*APX*转录丰度增加相关，而*WCI-2*和*POX-2*保持统计不变；ROS产生、抗氧化系统和病程相关蛋白是植物对真菌侵染响应的关键组分；*APX*诱导与小麦–PoT互作中ROS稳态和氧化还原调控机制参与一致；*PR5*诱导与病程相关防御反应激活一致，因*PR5*编码类甜蛋白（thaumatin-like proteins），已显示在小麦穗部感染*Magnaporthe*小麦稻瘟病病原后瞬时诱导；*WCI-2*和*POX-2*无显著变化不应解读为这些基因与响应无关，因防御信号高度依赖组织、基因型和侵染阶段；先前研究同样报道小麦–PoT互作及生物或化学激发后防御相关基因的差异时序调控；因此，本研究结果表明大蒜处理与选定防御相关基因表达变化之间存在关联，但需采用析因设计、更广泛时间进程分析及更多基因和基因型的额外实验来确定这些变化是否反映寄主防御反应的直接调节。

材料与方法部分：使用Perelló等（2026）通过分子方法鉴定的10个PoT菌株进行植物提取物和拮抗真菌离体试验，随后选择5个菌株（PY02、PY15、PY22、PY34和PY82）用于活体实验；所有菌株保存于CIDEFI真菌培养物保藏中心。*L. alba*（香芹酮chemotype）提取物由拉普拉塔国立大学生物化学与植物化学系提供，为含5%（v/v）丙二醇的制剂，原液浓度100,000 ppm（10%，v/v），实验制剂已配制好并直接施用，作者未进行额外提取、浓缩或重新配制；5%（v/v）丙二醇溶液作为溶剂对照；采用毒化培养基技术将制剂加入2%马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）。大蒜水提物由Laboratorio Rapela（阿根廷）提供，为水蒸气蒸馏获得的实验制剂，未经进一步提取或浓缩；采用固相微萃取–气相色谱–质谱（SPME-GC-MS）表征挥发性化合物，二烯丙基二硫化物（diallyl disulfide）为主要挥发性化合物，占相对色谱峰面积28.9%；因未用真实标准品定量校准，GC-MS数据仅用于定性表征；大蒜提取物以1、3或5 mL加入2% PDA，最终体积调至200 mL，对应终浓度0.5%、1.5%和2.5%（v/v）。拮抗真菌包括*T. harzianum* TH-FCCT-1155-4和TH-FCCT-63（由Bader等2020年分子鉴定并保存于GenBank，由INBIOTEC-CONICET提供）以及*E. nigrum* EPICC-01和EPICC-02（形态学鉴定并保存于CIDEFI）；按Bunbury-Blanchette和Walker（2019）在2% PDA上进行双培养评价，各菌株单独评价以考虑拮抗活性菌株依赖变异。所有离体试验在25 °C、12 h光/12 h暗光周期白色LED照明下孵育7天，每个提取物浓度、拮抗菌和病原菌株4个重复；评价MGI、产孢能力和形态改变；未处理对照为无处理PDA上生长的病原培养物，*L. alba*处理设5%（v/v）丙二醇溶剂对照。MGI计算公式为MGI（%）= [(Dc ? Dt)/Dc] × 100，其中Dc为未处理对照菌落直径，Dt为处理菌落直径。活体试验使用先前报道对PoT响应不同的商品小麦品种‘MS INTA 215’和‘Buck Aparcero’；苗期实验在21 ± 2 °C、12 h光周期受控温室维持，抽穗期实验在23 ± 2 °C相同光周期维持。基于离体结果，按ISTA（2020）卷纸法用*L. alba*（1000 ppm）、大蒜提取物（5 mL）、*E. nigrum* EPICC-02（2 × 10⁵ spores mL^?1）或*T. harzianum* TH-FCCT-1155-4（1 × 10⁶ spores mL^?1）处理小麦种子，14天后记录发芽率和异常幼苗；每品种每处理4个重复、每重复100粒种子（共400粒）， sterile distilled water为UTC，5%（v/v）丙二醇为*L. alba*溶剂对照。为评价降低PoT种子至幼苗传播及生长相关响应，种子经0.5% NaClO表面消毒、无菌蒸馏水冲洗后，浸入PoT分生孢子悬浮液（2 × 10⁵ spores mL^?1）20 min（150 rpm，25 °C）接种，层流罩下干燥后用相应拮抗菌或提取物处理；处理包括PoT + *L. alba*（500 ppm）、PoT + 大蒜（5 mL）、PoT + *E. nigrum*（2 × 10⁵ spores mL^?1）和PoT + *T. harzianum*（1 × 10⁶ spores mL^?1），PoT接种未处理种子（UTC+）和蒸馏水处理种子（UTC?）为对照，5%（v/v）丙二醇为*L. alba*溶剂对照；种子播于含灭菌发芽基质的多孔盘，每3天监测至GS 1.5，记录幼苗干重、叶片数、总长度、茎粗、相对叶绿素含量（SPAD index）和病害严重度；叶绿素于GS 1.2–1.3用Minolta SPAD 502叶绿素仪测定第二和第三叶，病害严重度用ASSESS 2.0软件定量；每品种/菌株组合和处理的20粒种子单独处理并播于20孔，每孔1苗为实验单元。为评价种子处理对后续叶部病害的影响，选用高感PoT的‘MS INTA 215’，与上述种子至幼苗传播实验不同，本实验种子在处理前未接种PoT；种子处理后播于20 L盆（土壤:灭菌沙1:1，v/v），温室21 ± 2 °C、12 h光周期维持；GS 1.5时叶面接种PoT菌株PY15或PY34（2 × 10⁵ spores mL^?1），按Martínez等（2019）在雾室维持48 h；14 dpi用ASSESS 2.0定量病害严重度和病斑密度（lesions cm^?2）；每处理每PoT菌株2盆、每盆5株，盆为实验单元，盆内5株为亚样本，统计分析前平均5株值，得每处理每菌株2个实验单元；未处理种子后续叶面接种PoT（UTC+）和未处理种子叶面喷蒸馏水（UTC?）为对照，两盆为独立重复并作为重复因子纳入统计分析。为评价叶面和穗部施用防控效果，选择5个PoT菌株（PY02、PY15、PY22、PY34和PY82）与基于离体和药害表现选择的TH-FCCT-1155-4和EPICC-02；大蒜提取物5 mL，*L. alba*因1000 ppm药害而用500 ppm，*L. alba*处理为含5%（v/v）丙二醇的500 ppm制剂直接施用不再重新配制；处理于苗期（GS 1.5）叶面喷施和抽穗期（GS 6.0）直接喷穗，治疗性处理于病原接种后72 h施用；拮抗菌以分生孢子悬浮液施用（*E. nigrum* 2 × 10⁵ spores mL^?1，*T. harzianum* 1 × 10⁶ spores mL^?1）；实验在20 L盆、12 h光周期、21 ± 2 °C（GS 1.5）或23 ± 2 °C（GS 6.0）下进行；病害严重度以症状叶面积百分比用ASSESS 2.0评估，病斑按Valent和Chumley量表（经Chavez和Kohli adapted for wheat blast）分类；0、7和14 dpi记录病害严重度和病斑密度并计算AUDPC；21 dpi评估穗部病害为病穗小穗百分比；成熟期（GS 9.0）于2025年实验测定千粒重；每品种/菌株组合和处理评价10株，每株单独种于20 L盆，每盆1株为独立实验单元；实验于2024和2025年独立进行；穗部病害严重度初始分析纳入年份和年份×处理互作，因二者均不显著，两年数据合并最终分析。基于活体结果，选择PoT菌株PY15、小麦品种‘MS INTA 215’和大蒜提取物组合进行RT-qPCR分析；基因表达按Portz等（2021）和Mogga等（2016）评价；于0、24、48和72 hpi收集叶片并立即液氮冷冻，每采样时间3个生物学重复、2个技术重复；总RNA用裂解和蛋白沉淀缓冲液提取，异丙醇沉淀、70%乙醇洗涤、DEPC处理水重悬；NanoDrop分光光度计测定RNA浓度并调至1 μg μL^?1；DNase I去除基因组DNA，按上述方案用HindAnchorT引物和RevertAid逆转录酶合成第一链cDNA；目标基因为病程相关蛋白5（*PR5*）、小麦化学诱导2（*WCI-2*）、抗坏血酸过氧化物酶（*APX*）和过氧化物酶2（*POX-2*），以延伸因子1-α（*EF1α*）为参考基因；引物及参考文献列于表3。RT-qPCR在48孔Applied Biosystems StepOne实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）上进行；每反应终体积15 μL，含1× SYBR Green qPCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific）、0.5 μmol L^?1各正向和反向引物、0.2 μg cDNA；扩增条件为95 °C初始变性10 min，随后40个循环95 °C 3 s和60 °C 30 s；每对引物进行最终熔解曲线分析（95 °C 15 s，60 °C 1 min，95 °C 15 s），检查熔解曲线评估扩增产物特异性；所有板均设无模板对照（NTC）和无逆转录（no-RT）对照；引物效率用基因特异标准曲线确定；相对转录丰度用LinRegPCR软件2021.1版计算并以*EF1α*表达水平归一化。统计分析中，百分比数据（MGI、发芽率和病害严重度）分析前经反正弦平方根转换；所有离体和活体实验数据用InfoStat v. 2023进行ANOVA；用Shapiro–Wilk或Kolmogorov–Smirnov及Levene检验结合诊断图评估正态性和方差齐性；4.3.4节种子处理实验统计模型纳入重复（M1和M2）和处理，使用每盆5株均值；2024和2025年独立实验穗部病害严重度数据初始ANOVA模型纳入年份、处理和年份×处理互作，因两品种年份和年份×处理均不显著，数据合并最终分析；假设不满足时进行适当转换，仍不满足则用Kruskal–Wallis检验（如图注所示）；多重比较用Tukey’s HSD检验（p < 0.05）。RT-qPCR数据每个目标基因单独用双因素ANOVA分析，处理（未处理对照和大蒜提取物）和时间（0、24、48和72 hpi）为固定因子，纳入处理×时间互作；3个生物学重复为实验单元，技术重复统计分析前平均；检测到显著效应或互作时，用Tukey’s HSD检验（p < 0.05）比较处理×时间组合均值。

结论部分：在本研究评价的受控条件下，植物提取物和有益真菌对PoT侵染小麦幼苗表现出直接抗真菌活性、病害抑制效应和生长响应改善。在评价的处理中，*T. harzianum*和*E. nigrum*显示作为生物防治剂的潜力，而*A. sativum*在多个离体和活体实验组合中显示抗真菌和病害抑制效应，并与特定采样时间点*PR5*和*APX*转录丰度增加相关。这些结果确定*A. sativum*、*T. harzianum*和*E. nigrum*为在小麦稻瘟病管理中进一步标准化温室和田间评价的候选物。未来研究应包括适当的未接种处理对照、参考杀菌剂，以及制剂稳定性、货架期、残留活性、拮抗菌持久性或植物定殖和田间效力的评估，以进一步评价其整合入小麦稻瘟病管理程序的潜力。