茄科作物病毒传统至分子诊断技术：从病原传播复杂性到精准检测体系的演进

《Plants》：Traditional to Molecular Diagnostic Technologies for Solanaceous Crop Viruses

　　

病毒性病害是全球茄科作物可持续生产的主要生物限制因素。其高度多样性、复杂的传播途径以及频繁的混合感染给精准病害治理带来了重大挑战。本文综述了主要茄科作物（番茄、辣椒、马铃薯）及特色作物（枸杞、茄子、烟草）中的病毒类型与传播机制，重点关注由烟粉虱（Bemisia tabaci）和蚜虫介导的传播途径，以及机械传播和种传传播。随后，研究人员综述了检测技术：传统方法缺乏灵敏度和特异性；分子方法已建立起完整的体系，其中常规RT-PCR和多联RT-PCR适用于批量筛查，RT-qPCR可实现灵敏定量，等温扩增（LAMP、RPA）支持快速现场诊断，高通量测序（HTS）在新病毒发现方面具有不可替代的作用。当前面临的挑战包括对特色作物病毒认识有限、田间适用工具不足以及针对重组株系的策略薄弱。未来工作应阐明病毒遗传变异与寄主—病毒互作机制，开发可快速田间部署的检测方法，并支持茄科作物病毒病的预警与综合治理。

本文围绕茄科作物病毒病的发生态势与检测技术演进展开系统综述。引言部分指出，茄科（Solanaceae）包含番茄（Solanum lycopersicum）、辣椒（Capsicum annuum）和马铃薯（Solanum tuberosum）等代表性作物，在全球粮食供应与农业经济中具有不可替代的地位，中国在马铃薯、番茄和辣椒的种植面积与总产量上均居世界前列。然而，集约化栽培扩张、气候变化与跨区域贸易使病毒病成为制约茄科产业可持续发展的首要生物限制因素，其传播途径多样、病毒演化迅速、田间混合感染普遍。在全球经济损失最严重的十种植物病毒中，烟草花叶病毒（Tobamovirus tabaci，TMV）、番茄斑萎病毒（Orthotospovirus tomatomaculae，TSWV）、番茄黄化曲叶病毒（Begomovirus coheni，TYLCV）、马铃薯Y病毒（Potyvirus yituberosi，PVY）、马铃薯X病毒（Potexvirus ecspotati，PVX）和黄瓜花叶病毒（Cucumovirus CMV，CMV）等六种病毒以茄科作物为主要寄主；全球已报道可侵染番茄、辣椒和茄子的病毒分别超过312种、187种和30种，且新重组株系不断出现、分布范围持续扩大。由于多数植物病毒在侵染早期呈潜伏状态、无明显外部症状，仅凭视觉诊断会延误干预时机，因此开发高灵敏、精准的检测技术并结合病毒鉴定与流行病学分析，对茄科作物病毒病的可持续治理至关重要。

第2部分总结主要侵染茄科作物病毒的传播途径与流行特征。依据主要介体，可将相关病毒划分为烟粉虱传播、蓟马传播、蚜虫传播以及机械传播或种薯/种子传播四类，各组在寄主范围、地理分布与危害程度上存在差异。烟粉虱传播的病毒是茄科生产中破坏性最强的病原类群之一，以TYLCV和番茄褪绿病毒（Crinivirus tomatichlorosis，ToCV）为代表，前者以持久循回型、后者以半持久型方式由烟粉虱传播。TYLCV起源于中东，现已呈全球大流行分布，以色列株系（TYLCV-IL）与温和株系（TYLCV-Mld）已在各洲番茄种植区定殖，对800余个全长基因组的系统发育分析揭示其持续跨洲传播与重组驱动的多样化；在中国，TYLCV是北方和东部主要设施番茄产区的主要病毒病原，山东、河南等地设施番茄发病率超过60%，并可侵染辣椒造成交叉感染危害，单株损失可达30–50%。ToCV于20世纪90年代中期在美国佛罗里达首次鉴定，现已至少在39个国家报道，寄主范围涵盖28科119种植物，番茄田间发病率可达100%，在中国南北主要产区广泛分布，与TYLCV共感染率可超过40%，10月混合感染率可达约50%。番茄黄化曲叶新德里病毒（Begomovirus solanumdelhiense，ToLCNDV）是另一种经济重要的烟粉虱传播病毒，以持久循回型传播，在地中海盆地和南欧已成为严重威胁。蓟马是第二类重要昆虫介体，TSWV由西花蓟马（Frankliniella occidentalis）和烟蓟马（Thrips tabaci）等以持久增殖型传播，成虫幼虫期获毒后可终生带毒，寄主范围超过1000种植物，在番茄、辣椒和烟草上引起严重斑萎、坏死环斑与产量损失。总体而言，烟粉虱与蓟马传播的病毒在高温干旱促进介体繁殖及设施栽培提供稳定越冬场所的条件下易流行，是全球番茄和辣椒生产的首要生物限制因素。

蚜虫传播病毒是茄科作物中分布最广、寄主多样性最高的类群，代表种包括CMV、PVY和辣椒脉斑驳病毒（Potyvirus capsivenamaculae，ChiVMV），均表现非持久型蚜虫传播的典型特征，传播效率高、扩散迅速，常见于辣椒、马铃薯和烟草并可跨作物交叉感染。主要蚜虫介体包括桃蚜（Myzus persicae）、棉蚜（Aphis gossypii）、马铃薯长管蚜（Macrosiphum euphorbiae）和台湾韭蚜（Neotoxoptera formosana），这些多食性蚜虫在短暂刺探过程中获毒与接种，是非持久型马铃薯Y病毒属（Potyvirus）和黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）病毒的高效介体。CMV寄主范围超过100科1200种植物，由全球80余种蚜虫非持久传播，在辣椒上引起“三落”现象，产量损失可达20–70%。PVY是栽培马铃薯全球范围内经济危害最重的病毒之一，自南美安第斯起源后分化为多个株系，由50余种蚜虫非持久传播，在中国主要马铃薯产区发病率常达20–48%；PVY与PVX协生共感染可显著提高PVX负链RNA积累与病毒粒子产量，加重产量损失。总体而言，蚜传马铃薯Y病毒属与黄瓜花叶病毒属病毒的非持久传播方式，结合介体多食性与快速繁殖潜力，使其易造成田间快速流行、跨作物溢出和难以单纯依靠化学防治控制的复杂混合感染。

机械传播与种传病毒具有异常稳定的病毒粒子，可在田间长期存活，通过农事操作中的汁液摩擦传播，或经种子和块茎垂直传播，代表种包括TMV、番茄褐色皱果病毒（Tobamovirus fructirugosum，ToBRFV）和马铃薯纺锤块茎类病毒（Pospiviroid fusituberis，PSTVd），对番茄、辣椒、马铃薯和枸杞危害严重。TMV寄主范围极广，病毒粒子在干燥病残体和惰性表面可保持侵染性数年，修剪、打顶和采收等农事摩擦是田间传播的主要途径，带毒种子可实现远距离传播，常与CMV混合感染加重危害。ToBRFV于2015年在约旦首次鉴定，随后通过带毒种子和种苗国际贸易迅速扩散至40余个国家，其病毒粒子高度稳定且传染性极强，并可克服番茄中广泛部署的Tm-22抗性基因，使既往抗病品种变为感病，病果出现褐色坏死斑、表面皱缩和不规则成熟而失去商品价值。PSTVd虽属类病毒而非病毒，但传播特征相似，经带毒马铃薯块茎和枸杞种苗及田间操作机械接触传播，作为全球检疫性病原常被纳入茄科病毒调查 panel。此类病毒不依赖昆虫介体，凭借极强的环境稳定性经带毒种苗远距离传播并在田间操作中持续扩散，难以根除，凸显了种苗检测与卫生栽培的重要性。文中还以气泡图汇总了韩国、突尼斯、坦桑尼亚、肯尼亚、土耳其、伊朗和黎巴嫩等地已发表田间流行病学调查数据，所用检测方法包括逆转录PCR（RT-PCR）、双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）和血清学指示等，气泡大小与病毒发病率成正比。

第2.4节指出传播途径复杂性对检测技术提出了差异化需求：烟粉虱和蓟马传播病毒（如TYLCV、ToCV、TSWV）扩散快、危害广，需要早期检测以实现及时预警和源头控制；蚜虫传播病毒（如CMV、PVY、ChiVMV）株系变异大、重组频繁，检测工具须能区分近缘株系；机械与种薯/种子传播的病毒及类病毒（如TMV、ToBRFV、PSTVd）高度稳定并经种植材料远距离传播，对种子和种苗认证提出很高要求；此外田间多类群混合感染普遍，需要多联检测能力。这些挑战共同推动茄科病毒检测由传统方法向分子诊断持续演进。

第3部分系统梳理茄科作物病毒检测技术的研究进展。过去数十年间，检测方法经历了从表型观察到核酸检测的代际转变，本节按技术原理及其应对上述挑战的优势与局限进行阐述。3.1节总结传统检测技术，包括症状视觉识别与经典理化测定两类：前者依赖经验丰富的植物病理学家对典型症状进行田间观察和指示植物生物测定，后者通过寄主特异性接种、电镜观察和血清学测定，利用病毒的侵染性、形态特征或抗原特性实现确诊。指示植物生物测定利用Nicotiana benthamiana、Chenopodium amaranticolor、Gomphrena globosa或Phaseolus vulgaris等指示种的寄主特异性症状，将汁液摩擦接种于幼苗并在温室维持1–3周，依据枯斑、花叶、环斑或坏死进行初步鉴定，该方法特异、廉价但费工费时、依赖温室且无法检测潜伏侵染。血清学检测以ELISA为主，利用病毒特异性抗体捕获植物提取物中的外壳蛋白，DAS-ELISA经捕获抗体包被、样品孵育、酶标抗体与底物反应后于405 nm读数，操作简便、成本低、可自动化用于大规模调查，但灵敏度中等、依赖高质量抗体且因交叉反应难以区分近缘株系。电镜（透射电镜或免疫电镜）可直接观察病毒粒子并检测低滴度病毒，但设备昂贵、需专业人员且样品制备复杂，不适合大规模筛查。总体而言，传统技术虽在操作简便性和稳定性上有所改进，仍存在灵敏度不足、易受环境与寄主干扰、无法区分近缘株系等缺陷，难以满足现代农业对早期检测、精准诊断和株系鉴别的需求，检测因此必须转向更高分辨率的方法，靶向病毒基因组核苷酸序列的分子技术已成为共识途径。

3.2节总结分子生物学检测技术。靶向病毒核酸的分子检测通过直接分析病毒遗传物质，利用序列特异性和稳定性克服传统方法的局限，可实现早期低滴度灵敏检测、精准株系基因分型和混合感染准确分析，为茄科病毒病从预警到综合防控的闭环管理提供关键支撑。3.2.1节介绍常规RT-PCR，按通量分为单重与多重两种形式：单重RT-PCR每反应使用一对病毒特异性引物检测单一靶标，适用于已知病毒的精准筛查；多重RT-PCR针对田间普遍存在的混合感染，可在单反应中同时检测多种病毒，简化操作、缩短时间并降低成本。多重RT-PCR在茄科病毒检测中应用广泛并在体系优化方面取得进展，其中双重引发寡核苷酸（DPO）引物由多聚脱氧肌苷连接两个引发区，可减少非特异性退火与错配延伸，对退火温度不敏感，适于多重反应；Yuan等（2021）设计DPO引物建立了针对检疫性病毒花生矮化病毒（Cucumovirus PSV，PSV）和番茄环斑病毒（Nepovirus lycopersici，ToRSV）的双重DPO-RT-PCR检测体系，特异性高且对退火温度不敏感，适于口岸快速高通量筛查；Bostan和Peker（2009）探讨了四重RT-PCR检测休眠马铃薯块茎中马铃薯S病毒（Carlavirus sigmasolani，PVS）、马铃薯卷叶病毒（Polerovirus PLRV，PLRV）、PVX和PVY的可行性，经条件优化可稳定检测PVS、PLRV和PVX；Wang等（2005）基于PVX、PVY、马铃薯A病毒（Potyvirus atuberosi，PVA）、PVS和PLRV的外壳蛋白（CP）或P1基因序列设计特异性引物并建立多重RT-PCR体系，灵敏度较ELISA高100倍以上，可在混合感染样品中同时检测多个靶标病毒。对于所有RT-PCR扩增形式，扩增产物身份通常经双向Sanger测序并结合NCBI BLAST+ 2.17.0对GenBank数据库进行BLASTn比对确认，该验证步骤可检验引物特异性、排除近缘病毒或株系的交叉扩增，对靶向高变异病毒或出现异常条带大小的检测尤为重要。综上，常规与多重RT-PCR为茄科作物单一及混合病毒感染检测提供了稳健且广泛采用的平台，但其定性输出限制了其在病毒载量监测中的应用。

3.2.2节介绍实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR），该技术通过在PCR反应体系中引入荧光探针、实时监测扩增过程中荧光信号的积累并利用已知浓度标准品建立标准曲线来定量初始模板，具有特异性高、灵敏度高、易于操作的特点，已广泛应用于科研与产业实践。Yang等（2024）针对主要马铃薯产区危害严重的PVY、PVS和PLRV建立了相应RT-qPCR检测体系，表现出高扩增效率与特异性；Li等（2020）基于PVY外壳蛋白保守序列建立PVY RT-qPCR检测体系，灵敏度较常规RT-PCR高1000倍，对来自山东、青海、贵州、黑龙江和河北五省马铃薯样品的PVY检出率显著高于常规RT-PCR。在全球范围内，RT-qPCR已取代DAS-ELISA成为欧盟、北美和大洋洲认证种薯计划中PVY和PLRV的参考定量方法，其对低滴度潜伏块茎感染的优越检测能力提高了种传病毒筛查准确性和脱毒效率。RT-qPCR虽在种薯认证和流行病学监测中具备高特异性、高灵敏度和准确定量优势，但成本、基础设施要求和对已知序列的依赖限制了其田间部署及对新变异株的检测，仍需进一步优化。

3.2.3节介绍等温扩增技术，此类技术在恒定温度下实现核酸扩增，无需热循环仪即可对靶序列进行指数扩增，已越来越多地应用于茄科病毒的快速检测，目前以环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）最具代表性。LAMP由Notomi等（2000）建立，针对靶基因六个特定区域设计四条引物，在链置换聚合酶作用下于60–65 °C恒温反应，1 h内可将DNA模板扩增至百万拷贝级，无需热循环设备。由于LAMP直接扩增DNA，对占茄科病毒多数的RNA病毒需增加逆转录步骤，研究人员将逆转录与LAMP结合建立了逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测体系：Przewodowska等（2015）建立的PVY RT-LAMP方法灵敏度较常规RT-PCR高可达100倍，且与PVS、PLRV等非靶标病毒无交叉反应；Caruso等（2024）开发的TSWV实时RT-LAMP检测灵敏度较RT-qPCR高100倍，应用于简化样品制备的田间番茄和辣椒样品时阳性检出率提高至37%，在检测无症状感染方面优势尤为突出；针对ToMV的RT-LAMP方法可在5 min内于番茄样品中检出病毒。RPA由Piepenburg等（2006）首次报道，基于T4噬菌体DNA复制机制，依赖UvsX重组酶、其辅因子UvsY、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换Bsu DNA聚合酶，UvsX–引物复合物扫描同源序列并侵入双链DNA形成D-loop，SSB稳定置换链，Bsu聚合酶延伸新链实现指数扩增，在37–42 °C下20 min内完成扩增。RPA已广泛应用于茄科作物病原检测：Babu等（2018）指出RPA可在恒温下实现快速、低纯度扩增，适于包括TYLCV在内的茄科DNA病毒；近期应用扩展至茄科RNA和DNA病毒，针对ToBRFV的RT-RPA结合CRISPR-Cas12a和CRISPR-Cas9可在约1 h内于侧流装置上实现可视化检测；针对ToLCNDV和TYLCV的双重RPA检测在25 min内灵敏度达10⁴ copies·mL^?1，可同时检测植株和烟粉虱中的两种病毒。近年来RPA与CRISPR/Cas系统的结合进一步提升了检测性能，Paul等（2025）建立了靶向辣椒曲叶病毒（Begomovirus chillicapsici，ChiLCV）AC1基因的RPA辅助CRISPR-Cas12a（DETECTR）可视化检测平台，检测限低至7 fg，可直接从辣椒叶片粗提物中检测而无需复杂核酸纯化步骤。

3.2.4节介绍高通量测序（HTS），亦称下一代测序（NGS），该技术不依赖传统分离培养方法或已知序列信息，可对样品中所有核酸进行无偏测序，结合生物信息学分析可鉴定已知和未知病原，近年来在茄科作物病毒鉴定、病毒组分析和新病毒发现中展现出独特优势。在茄科作物病毒学领域，HTS已广泛用于分析病毒种类组成和种群结构：Rivarez等（2021）指出HTS已鉴定出多达312种与番茄相关的病毒、卫星和类病毒，2011至2020年间新发现的45种病毒中有14种系首次借助HTS鉴定；在辣椒病毒研究中，Feng等（2017）采用深度小RNA测序分析贵阳地区辣椒病毒病样品，结果表明存在由蚕豆萎蔫病毒2号（Fabavirus betaviciae，BBWV2）、ChiVMV、CMV和辣椒内源RNA病毒（Alphaendornavirus capsici，BPEV）组成的混合感染，检测效率显著高于传统方法。HTS在新病毒发现和病毒变异监测方面具有独特且不可替代的优势：在病毒积累风险高的无性繁殖马铃薯中，常规方法难以充分解析潜伏与混合感染，而HTS可深入剖析病毒种群结构并鉴定重组变异；对枸杞等高价值特色作物，HTS亦成为关键鉴定工具，如Fan等（2023）通过小RNA测序在宁夏枸杞样品中检出包括PSTVd在内的多种病毒，为后续病害管理奠定基础。除短读长HTS平台外，Oxford Nanopore Technologies（ONT）的长读长测序为植物病毒诊断提供了补充途径，其通过测量核酸链穿过生物纳米孔时的离子电流波动实现无标记实时单分子测序，核心优势包括经掌上型MinION设备实现田间便携、周转快速以及可跨越病毒全长基因组的长读长，便于对重组分离物进行从头组装和区分样品内混合株系，近期应用涵盖番茄和辣椒病毒的现场监测、病毒RNA直接测序及枸杞病毒组分析；主要局限是原始读长错误率相对短读长平台偏高，可通过高测序深度、一致性校正和碱基识别算法进步加以弥补，因此ONT最适合作为既有短读长HTS平台的补充而非替代，尤其在优先考虑速度和田间可部署性时。综上，短读长与长读长HTS平台的互补使用已改变茄科及特色作物的病毒组分析和病原发现，在病毒种群多样性、重组变异和传播动态解析方面达到前所未有的分辨率，既推动了基础流行病学认识，也为下一代靶向检测方法的开发奠定基础。

3.2.5节介绍株系与变异鉴别方法。鉴于通用存在/缺失型检测无法充分区分株系变异明显的介体传播病毒（如PVY的O、N和NTN株系，CMV的IA、II和III亚组以及TYLCV重组变异），研究人员在上述平台基础上开发了靶向种内多样性的方法。PCR-RFLP基于酶切图谱可低成本地对分离物分型，但受限于预设限制性酶切位点；在茄科作物中，外壳蛋白扩增子的RT-PCR-RFLP已用于将番茄和辣椒CMV分离物归入I和II亚组，为测序前的经济型亚组筛查提供手段。此外，靶向分化基因组区域的株系特异性RT-PCR和TaqMan小沟结合（MGB）探针可在单样品中同时区分主要株系，例如在休眠马铃薯块茎中，靶向外壳蛋白基因和重组接头的多重RT-PCR可区分PVY^O、PVY^N、重组型PVY^N:O和PVY^NTN分离物，而靶向株系特异性SNP的MGB探针可在单反应中实现闭管鉴定。单链构象多态性（SSCP）和变性梯度凝胶电泳（DGGE）虽技术难度较高，但可在无先验知识的情况下揭示序列变异，例如对RT-PCR产物的SSCP筛查将81个田间CMV分离物归为14种构象单倍型，随后用代表性外壳蛋白序列确定IA/IB亚组，说明此类技术可为验证性测序优先筛选分离物。在更高分辨率层面，借助单核苷酸多态性（SNP）和重组检测工具的HTS变异 calling 越来越多地用于直接从田间样品解析混合种群和新发重组体，例如在番茄和甜椒中，HTS解析出常规检测会判为单一阳性的共感染重组PVY株系（N-Wi、NTNa和NTNb），更深测序揭示了妨碍常规基因组组装的混合N型和O型种群；类似地，大规模系统发育与重组检测分析追踪了TYLCV-IL、TYLCV-Mld及番茄种群中新发重组变异的全球传播与演化历史。综上，这些株系鉴别方法直接应对广寄主范围和快速演化多样化带来的流行病学挑战，为追踪病毒演化、 delineating 传播途径和支持株系靶向病害管理提供了必要分辨率。

第4部分为结论与展望。本文系统总结了茄科病毒三大传播途径的流行病学特征，明确了检测技术的核心需求，即预警、精准株系分型、种苗认证和混合感染解析；在此基础上全面概述了检测技术的演进：常规RT-PCR奠定分子检测基础，RT-qPCR实现准确定量，等温扩增促进快速现场诊断，HTS在新病毒发现方面具有独特价值。尽管进展显著，仍存在若干关键挑战，未来应聚焦以下方向：（1）加强特色作物病毒基础研究，目前枸杞、茄子等特色作物的病毒资源调查、遗传变异规律和致病机制研究相对薄弱，缺乏针对性检测靶标和技术体系；需加强特色作物病毒系统调查以明确优势病毒种群及其地理分布格局，深入解析病毒与寄主互作机制以鉴定高度保守和特异的分子靶标，为专用检测技术开发提供理论基础；未来研究还将系统探索以下方向：利用HTS构建宁夏枸杞病毒全景图，明确优势病毒种群及地理分布特征；结合介体昆虫调查与种苗调运信息，分析病毒群落的分布特征与传播规律；系统评估病毒感染对枸杞活性成分和外观品质的影响，揭示病毒致病性与果实品质劣变之间的机制联系。（2）推进田间可部署与多联检测技术，目前多数分子检测技术仍依赖实验室设备、缺乏现场适应性，混合感染同步检测体系尚不完善，难以满足田间实际需求；未来应聚焦低成本、便携、可视化方案，优化等温扩增与CRISPR/Cas系统及生物传感器的耦合方案以开发手持检测装置，同时通过优化引物探针设计和反应条件加强多联检测体系开发，实现多种病毒的同时准确检测，提升田间应用的实用性与效率。（3）促进学科交叉融合，病毒检测技术的突破依赖多领域协同创新，未来应推动分子生物学、生物信息学、微电子学和材料科学的交叉联合研究：一方面将检测技术与智慧农业监测平台整合，实现病毒病的实时预警与动态监测；另一方面整合光谱信息、病理特征和生理响应等多维数据，开发更稳健的检测模型与分析算法；同时加强种苗检疫与田间防控的技术衔接，建立“检测—预警—防控”一体化技术体系，为茄科作物病毒病的绿色可持续治理提供坚实基础。