木麻黄（*Casuarina equisetifolia* L.）抗台风候选优株的表型选择、遗传变异与全基因组SNP指纹图谱构建

《Plants》：Phenotypic Selection, Genetic Variation, and Genome-Wide SNP Fingerprinting of Typhoon-Surviving Candidate Individuals in Casuarina equisetifolia

　　

木麻黄（*Casuarina equisetifolia* L.）是热带与亚热带地区沿海防护林营造的关键先锋树种。然而，长期依赖有限数量的优良无性系已导致其遗传基础变窄、抗逆性下降，亟需开展优良单株选择并构建分子身份标识以支撑种质的精准鉴定。本研究以来自23个种源的108个10年生半同胞家系为材料，对树高（H）、胸径（DBH）、材积（V）和抗风倒等级（WTRG）4个性状进行了评价。区组间、家系间及区组×家系互作在各性状上均检测到极显著变异（p < 0.001）。表型变异系数与遗传变异系数分别为47.52%–81.55%和9.43%–14.89%。采用联合选择共选出29株优良单株，H、DBH、V和WTRG的遗传增益分别为6.02%、11.30%、34.44%和3.84%。对这29株优良单株进行全基因组重测序，获得高质量数据，经初步过滤后得到3,533,880个高置信度SNP位点。经严格质控后保留379个核心SNP标记，其平均多态信息含量（PIC）为0.366，次等位基因频率（MAF）为0.420，表明其具有用于个体鉴别的潜力。基于这些核心SNP构建了DNA指纹数据库，并结合QR码技术为每株优良单株创建了数字化身份标签。研究结果表明，供试木麻黄群体具有可观的遗传变异并具备遗传改良潜力；所建立的基于SNP的指纹图谱体系及QR码数字化标签平台，为优良基因型的精准鉴定与种质管理提供了技术支撑。

一、研究背景与立题依据

木麻黄（*Casuarina equisetifolia* L.）天然分布于热带至亚热带沿海地区，包括澳大利亚昆士兰北部、泰国南部和马来西亚。因其速生、根系发达及耐风沙、耐盐等较强生态适应性，已成为全球沿海防护林营建和困难立地植被恢复的主要先锋树种之一。中国东南沿海和印度的木麻黄人工林面积分别已超过30万hm²和50万hm²，在减轻沿海自然灾害、改善滨海土壤和促进生态修复方面发挥着重要作用。然而，长期依赖有限数量优良无性系造林，导致其遗传基础逐渐变窄、整体林分抗逆性明显下降，严重制约其生态防护功能的持续发挥；同时，全球气候变化驱动下风暴潮和台风频率与强度增加，对现有种质资源构成更大环境压力，因此亟需选育抗逆性更强的育种材料以提升木麻黄人工林的适应性与稳定性。

木麻黄遗传改良长期以有性育种与无性利用为核心策略。自20世纪80年代以来，中国通过中澳、中法等国际合作项目先后从不同国家和地区引进70余个种源，并在福建、广东、海南等地营建了系统的种源试验林。已有研究基于早期生长数据开展了家系选择，验证了种源间在树高、胸径和材积上的显著差异并筛选出优良种源。然而，尽管在种质评价和育种群体构建方面取得较大进展，木麻黄仍缺乏优良单株的系统筛选及其DNA指纹图谱，目前尚无能够快速准确鉴定育种材料的分子身份体系，制约了优良基因型的知识产权保护与良种推广。

单核苷酸多态性（SNP）标记因遗传稳定性高、检测成本低、通量高，已广泛应用于林木遗传多样性分析和DNA指纹图谱构建。已有研究利用SNP标记成功构建了茶树和澳洲坚果种质的DNA指纹，但将该方法应用于木麻黄优良单株鉴定与指纹构建尚未见报道。为此，本研究以23个种源的108个半同胞家系为对象，系统测定10年生树高（H）、胸径（DBH）和材积（V）等生长性状，并借助超强台风"杜苏芮"自然发生的机会评估每株树的抗风倒等级（WTRG），分析生长性状与抗风性的变异规律，结合两类性状进行优良单株选择；进而对优良单株进行全基因组重测序，评估其遗传多样性、筛选核心SNP位点并构建DNA指纹图谱。本研究旨在为木麻黄优良单株的精准选择和分子身份构建提供技术支撑，同时为拓宽遗传基础、定向培育抗风新种质奠定种质基础。

二、研究取得的主要结论及意义

研究人员通过对108个半同胞家系4个性状的方差分析、变异参数与遗传力估计、相关分析及联合选择，明确了供试群体存在极显著的区组、家系及互作变异，表型变异主要受环境效应驱动而加性遗传组分相对有限；以3%选择强度和WTRG = 4为标准选出29株优良单株，各性状获得稳定的遗传增益；通过全基因组重测序和严格筛选获得379个高多态性核心SNP，成功构建了29株优良单株的DNA指纹图谱并生成QR码数字身份标签。该研究建立了一套整合表型评价、遗传评估与分子鉴定的优良单株选择技术路径，为木麻黄良种选育和种质精准鉴定提供了参考，对优良基因型的知识产权保护和种质数字化管理具有重要意义。

三、主要关键技术方法

研究以福建惠安赤湖国有防护林场2014年营建的23个种源108个半同胞家系种源/家系试验林（随机完全区组设计，6个区组）为材料队列，2013年于该场苗圃按家系播种，材料包括已选中国优良种质及引自澳大利亚、印度、越南、肯尼亚、马来西亚、泰国、瓦努阿图、贝宁和所罗门群岛的种质。方法上采用线性混合模型（lme4包，R 4.4.2）估计方差组分，计算表型与遗传变异系数、广义与狭义遗传力及遗传增益，并以育种值多性状评价法结合聚类分析进行优良单株选择。对入选单株采用改良CTAB法提取基因组DNA，经Illumina NovaSeq 6000平台150 bp双端测序，用fastp质控、bwa-mem2比对参考基因组（GCA_028551475.1）、GATK v3.8检测变异并进行硬过滤。基于高质量SNP用MEGA X构建邻接（NJ）系统发育树、EIGENSOFT进行主成分分析（PCA）、Admixture分析群体遗传结构；用VCFtools按100%检出率、MAF ≥ 0.20、HWE p > 0.01、PIC ≥ 0.35及100 bp邻域去冗余逐步过滤，再用PLINK进行连锁不平衡精简获得核心SNP；最后编码基因型并利用qrencode软件生成QR码。

四、研究结果

2.1 生长性状与抗风倒等级的变异及相关分析

对H、DBH、V和WTRG 4个性状进行统计分析与方差分析（ANOVA）表明，供试群体平均WTRG为2.96，整体抗风性较强；4个性状在区组间、家系间及区组×家系互作上均差异极显著（p < 0.001），其中区组效应对所有性状的F值最大，提示试验地环境异质性是驱动表型变异的首要因素。4个性状的表型变异系数（PCV）为47.52%–81.55%，均高于相应的遗传变异系数（GCV），表明表型变异主要由环境效应驱动而加性遗传组分相对有限；广义遗传力为0.3433–0.4989，属中等水平，其中V最高（0.4989）、WTRG最低（0.3433），反映各性状遗传控制程度不同；狭义遗传力普遍较低（0.1093–0.1809），进一步证实加性遗传方差占总表型方差比例较小。生长性状（H、DBH、V）间表型相关与遗传相关均极显著正相关（p < 0.001），以DBH与材积相关最高（表型r = 0.961，遗传r = 0.953）；WTRG与H、DBH、V则呈显著负的表型和遗传相关。

2.2 优良单株选择

以H、DBH、V和WTRG为评价指标，采用育种值多性状评价法结合聚类分析对1050株个体进行综合评价。欧氏距离设为5时，供试群体可划分为4个类群：类群I含36株，4个性状遗传增益均为正（H 6.47%、DBH 12.46%、V 39.92%、WTRG 2.15%），归为速生个体；类群II含536株，遗传增益分别为1.94%、2.49%、4.87%和2.09%；类群III含454株，遗传增益均为负（?2.38%、?3.40%、?7.85%、?2.37%）；类群IV含24株，亦为负增益（?6.81%、?9.08%、?16.00%、?7.10%），类群III和IV归为慢生个体。从表现最优的类群I中进一步选出29株WTRG为4的个体作为优良单株，其平均树高、胸径、材积和WTRG分别为12.04 ± 0.99 m、18.00 ± 2.04 cm、0.1368 ± 0.03 m³和4，分别超出群体均值3.37 m、7.41 cm、0.0626 m³和1.04；各性状平均遗传增益分别为6.02%、11.30%、34.44%和3.84%。入选优良单株在保持WTRG为4的同时材积生长显著提升，为后续速生抗风木麻黄品种选育与遗传改良提供了候选种质材料。

2.3 基因组重测序质量与SNP变异检测

29株优良单株的原始测序数据经严格过滤与质控后，高质量clean reads比对至木麻黄参考基因组。数据显示各样本平均clean bases为4.17 Gb，Q20和Q30分别为97.30%–98.21%和93.08%–95.21%（均值97.86%和94.42%），碱基识别质量高；GC含量为36.63%–40.26%（均值37.58%），碱基组成正常。29个样本平均比对率为93.64%，平均测序深度13.69×，1×、5×和10×深度下基因组覆盖率平均分别为95.19%、86.60%和62.33%，表明重测序数据覆盖度与比对质量良好，为后续全基因组变异（SNP和InDel）检测奠定基础。基于高质量比对结果，用GATK进行变异检测与硬过滤，全基因组共获得3,533,880个高质量SNP和618,489个InDel，表明29株优良单株间基因组变异丰富。高质量SNP的核苷酸替换类型统计显示平均转换/颠换比（Ti/Tv）为2.05，处于植物基因组常见范围内，支持所鉴定SNP位点的可靠性。染色体水平上基因、SNP和InDel密度分布显示三者呈非均匀分布，部分染色体区域变异密度存在差异。SNP功能注释表明变异位点主要富集于非编码区，内含子、基因间区及上下游区域变异合计占全部SNP的84.43%，仅10.35%的SNP位于编码序列（CDS）；CDS区内同义突变（51.51%）与非同义突变（47.63%）比例接近1:1。InDel的基因组分布模式与SNP总体一致。该变异数据集为后续核心SNP标记筛选和DNA指纹构建提供了丰富资源。

2.4 群体遗传结构分析

基于3,533,880个高质量SNP标记分析29株优良单株的群体遗传背景。系统发育树显示供试个体分布于多个分支，部分聚类模式似与其地理来源相关；主成分分析与该分化趋势一致，PC1和PC2分别解释总变异的56.9%和13.73%，累计解释率为70.63%，样本总体集中于二维散点图，但部分个体呈离散分布，提示群体内存在遗传异质性。群体结构分析显示K = 3时交叉验证误差最低，据此将29株个体划为3个亚群：第一亚群含9个样本，地理来源多样，包括肯尼亚、所罗门群岛、中国、泰国和马来西亚；第二亚群亦含9个样本，均来自泰国，呈现明显的地理聚集；第三亚群含11个样本，其中2个来自印度、9个来自中国。综上，系统发育树、主成分分析和群体结构分析一致表明29株优良单株遗传背景多样，遗传结构在一定程度上与地理来源相关，为后续核心SNP标记筛选提供了依据。

2.5 核心SNP筛选与遗传多样性分析

为构建适用于木麻黄优良单株鉴定的DNA指纹，采用兼顾数据完整性、基因组分布均匀性、次等位基因频率（MAF）和多态信息含量（PIC）及侧翼序列稳定性的严格筛选策略，最终从高质量SNP数据集中选出379个核心SNP位点。逐步过滤过程为：经基本质控（100%检出率、MAF ≥ 0.20、HWE p > 0.01）保留173,194个SNP；应用PIC ≥ 0.35阈值后保留65,214个；去除100 bp内存在邻近变异的标记后保留54,926个；最终对剩余SNP集进行连锁不平衡精简后获得379个核心SNP位点。遗传多样性评价显示，379个位点观测等位基因数均为2.00，确证均为双等位变异；平均有效等位基因数为1.937，表明群体内等位基因频率分布相对均衡；平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.377和0.483；Nei氏多样性指数、Shannon多样性指数和PIC均值分别达0.492、0.676和0.366，总体平均MAF为0.420。上述参数表明严格筛选的核心SNP集在供试群体内多态性高、遗传多样性丰富，支持其用于本研究个体鉴定，为木麻黄DNA指纹构建和种质鉴定提供了依据。

2.6 优良单株DNA指纹构建与QR码生成

分析379个核心SNP位点在木麻黄基因组9条染色体上的物理分布，结果显示这些位点分布于全部9条染色体，相邻位点最小物理距离为552 bp，无明显局部聚集，表明所选标记呈稀疏且全基因组覆盖的模式。基于这些核心位点构建了29株优良单株的DNA指纹，指纹图谱显示每个个体均呈现高度特异的基因型组合，个体间区分清晰，表明所选核心SNP集鉴别力强，能够精准区分29株供试个体。为便于指纹信息的存储、检索与实际应用，进一步将个体特异基因型数据编码并转换为相应的身份QR码，实现木麻黄种质遗传信息的快速读取与数字化管理。每个QR码编码一段纯文本字符串，包含个体身份（名称/编号）及全部379个核心SNP位点的完整基因型图谱；指纹编码中位点顺序与379个核心SNP在染色体上的物理排列一致，作为QR码的解码依据。

五、讨论与结论

讨论部分指出，变异与遗传是遗传改良的前提和基础。本研究群体表型变异系数（47.52%–81.55%）高于已有木麻黄苗期表型变异报道，可能与试验地立地条件复杂、树木生长中持续遭受风害和盐雾等多重胁迫而放大表型可塑性有关；但区组效应F值最大，说明试验地环境异质性是小生境是表型变异的主要来源，且风害仅基于单次台风评估，若区组间在挡风、地形、边缘效应或土壤水分上存在差异，WTRG结果可能受非遗传因素偏倚；台风等极端事件作为强选择压力进一步加剧了存活个体间的表型分化。遗传变异系数为9.43%–14.89%，属低至中等水平，提示表型变异相当部分源于基因型×环境互作和非遗传噪声，加性遗传组分相对受限，这与遗传力估计趋势一致。10年生生长性状遗传力为0.1093–0.4989，总体偏低至中等，低于已有4年生木麻黄报道，说明生长性状遗传力随林龄增长而下降，可能因幼龄期养分与生长空间竞争较弱，随年龄增长邻体干扰加剧、生长更受环境制约，导致基因型×环境互作方差增大、遗传力下降；显著的区组效应也可能通过增大环境方差而降低遗传力估计，故此处遗传力应理解为特定微环境条件下的估计值而非固定参数。低至中等的遗传变异系数和遗传力可能与供试群体在长期环境胁迫下经历定向选择、加性遗传组分趋于收敛的假说相符，但本研究未获得定向选择的直接证据，该解释仍属推测，尚需进一步验证。相关分析表明V与DBH的表型和遗传相关系数最高，与已有4年生木麻黄报道一致，提示DBH可作为材积改良的有效间接选择指标，二者高遗传相关也暗示控制两性状的基因可能存在紧密连锁或多效性，利于育种中的联合选择。本研究以3%选择强度和WTRG = 4为阈值选出29株优良单株，各性状遗传增益分别为6.02%、11.30%、34.44%和3.84%；但研究仅基于单次台风事件，推断的选择效应和相关表型分化未必能完全反映反复台风干扰的长期后果，未来将开展多地点、多次台风事件的观测，记录风暴露与风害的空间分布，并采用混合或空间模型分离遗传与非遗传效应。研究还指出，从1050株中选出29株（选择比例约2.76%），尽管强度选择可带来显著短期遗传增益，但不应忽视对群体遗传多样性的潜在代价：若下一代仅由这29株随机互交产生，有效群体大小将明显下降，增加近交累积、遗传漂变和稀有等位基因丢失风险，进而削弱群体对病虫害、气候变化和未来台风胁迫的长期适应潜力；尤其WTRG选择基于单次台风后的风害表现且区组效应为所有性状最大变异来源，入选个体可能部分反映小区微环境或风暴露差异而非稳定的遗传抗性，进一步放大选择偏倚。因此未来育种不宜仅依赖少数优良单株随机互交，更稳妥的策略是结合家系内与家系间选择、保留足够候选家系和个体、控制交配亲缘关系、开展多性状多地点选择，并利用分子标记持续监测遗传多样性和近交水平，同时有计划地引进新种源或开展杂交以拓宽遗传基础，平衡短期遗传增益与长期育种潜力。入选优良单株主要来自中国和泰国，分别占44.83%和34.48%，中国来源占比最高可能因供试种质的亲本材料经长期引种和本地驯化已对中国沿海立地形成较强生态适应性；泰国来源材料表现亦突出，可能因试验地与泰国源区同受季风环流影响、高温高湿气候相似，为引种材料提供了有利生长环境；未来木麻黄种质收集引进可更多关注泰国及气候相似地区材料，但其在不同生态条件下的适应性和推广潜力仍需区域试验评价。SNP标记因丰富、分布广、稳定性高已成为种质资源遗传研究的理想工具；本研究对29株优良单株进行全基因组重测序鉴定SNP并筛选出379个核心位点，其观测等位基因数2.000、有效等位基因数1.937、Shannon多样性指数0.676均高于已有采用AFLP和ISSR标记对木麻黄种源和克隆的研究，差异可能源于SNP标记检测效率更高、基因组覆盖更广，能更灵敏地捕获不同位点的遗传变异信息；但需注意这些估计来自仅29个个体的发现群体且核心位点系在该群体内按多态性筛选，可能不能代表全基因组或物种水平的遗传多样性，也不应外推至更广泛育种群体。379个核心SNP主要用于个体鉴定，足以区分29株入选个体，但对未来更大的育种群体鉴别力可能有限：因该面板由少数个体开发，可能存在确证偏倚，偏向发现集中多态的位点而低估稀有等位基因、低频变异及采样个体未覆盖区域的变异；应用于数百至数千个个体（包括近缘、全同胞或克隆）时，可能不足以进行个体鉴定或亲缘关系判定，也不适于群体遗传结构分析、全基因组关联分析和基因组选择；此外这些核心SNP尚未在独立样本集中验证，其群体水平的鉴别力和可靠性仍待确认。未来应扩大种质采样、在独立群体中验证该面板，并评估其个体识别概率、同胞排除概率、次等位基因频率和连锁不平衡，必要时开发更高密度SNP芯片或基于全基因组重测序的更大标记集，并与长期多地点表型评价结合以鉴定表型优良、遗传表现稳定的核心无性系。

结论部分译述如下：本研究评价了木麻黄23个种源108个半同胞家系的表型和遗传变异特征，结果表明表型变异系数为47.52%–81.55%，遗传变异系数为9.43%–14.89%；以3%选择强度和WTRG = 4为标准选出29株优良单株，H、DBH、V和WTRG的遗传增益分别为6.02%、11.30%、34.44%和3.84%；进一步基于全基因组重测序从这29株优良单株中鉴定出379个核心SNP位点并构建了DNA指纹数据库，结合QR码技术为每株优良单株赋予数字化身份标签。本研究提供了一套整合表型评价、遗传评估与分子鉴定的优良单株选择方法，为木麻黄品种选育和种质鉴定提供了参考。