《Plants》：Integrated Transcriptomic and Metabolomic Analyses of In Vitro Tuberization of Siraitia grosvenorii
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罗汉果（Siraitia grosvenorii）为葫芦科药食两用植物，其果实积累罗汉果苷（mogrosides），即甜度约为蔗糖300倍的无热量天然甜味剂，广泛应用于食品与饮料。既往罗汉果组织培养研究多集中于再生植株，而离体块茎形成的代谢事件尚缺乏系统表征。
罗汉果（Siraitia grosvenorii）为葫芦科药食两用植物，其果实积累罗汉果苷（mogrosides），即甜度约为蔗糖300倍的无热量天然甜味剂，广泛应用于食品与饮料。既往罗汉果组织培养研究多集中于再生植株，而离体块茎形成的代谢事件尚缺乏系统表征。本研究联合形态学观察、淀粉与可溶性糖定量、时序转录组学及广泛靶向代谢组学，解析罗汉果离体块茎形成过程中的代谢重编程。接种后45 d出现可见块茎结构，并在整个发育过程中持续积累淀粉。淀粉与蔗糖代谢及黄酮生物合成是调控碳水化合物与黄酮积累的核心通路。研究筛选出候选MYB、bHLH与ERF转录因子（TFs），以探讨上述代谢变化的潜在上游调控。结果表明，罗汉果离体块茎形成是一个多阶段、高度协调的过程，为选育优质繁殖材料及将该物种开发为功能性食品配料与天然甜味剂来源提供了分子基础。
研究背景：罗汉果（Siraitia grosvenorii (Swingle) C. Jeffrey）为葫芦科多年生藤本药食两用植物，其果实积累葫芦烷型三萜皂苷类化合物——罗汉果苷（mogrosides），属无热量高倍天然甜味剂，甜度约为蔗糖的300倍，并具抗氧化、降血糖与降血脂等生物活性；此外，其根部亦分离获得多种生物活性成分。随着栽培面积扩大与产业快速发展，病害发生率上升，野生资源与原生境日趋减少，种质资源保护对产业可持续发展至关重要。块茎既是重要的营养贮藏器官与繁殖材料，也是植物基因工程与分子农业的有效工具，其发育状况影响植株长势与产量。离体块茎诱导体系已在多种药食两用块茎作物中广泛研究：马铃薯中碳水化合物与酚类活性成分是反映块茎营养品质的重要指标，黄酮代谢在驯化过程中发生显著重塑，花青素积累受光响应转录因子调控，MYB、bHLH与ERF等转录因子家族是协调器官膨大、碳分配与次生代谢的核心枢纽；山药微型块茎形成受多种植物激素调控并与初级代谢紧密协调；甘薯块茎发育中差异表达基因显著富集于淀粉与蔗糖代谢及黄酮生物合成通路。然而，针对罗汉果离体块茎形成过程代谢动态的系统研究仍十分匮乏。为此，研究人员开展本研究，旨在刻画罗汉果离体块茎发育过程中转录本与代谢物的动态变化，解析调控营养与功能成分积累的调控网络，为选育优质繁殖材料、促进块茎资源作为功能性食品配料与天然甜味剂的开发利用提供依据。
研究人员以"伯林2号"罗汉果品种（保存于广西壮族自治区农业科学院特色作物研究院中药种质资源圃）为材料，经无菌苗培育后，取带腋芽茎段接种于含0.01 mg/L NAA、0.50 mg/L 6-BA、1.00 mg/L多效唑（PP333）、60 g/L蔗糖的1/2 MS培养基进行块茎诱导，于接种后0、15、30、45、60、75、90 d取样，每时期设3个生物学重复。研究得出：罗汉果离体块茎形成是多阶段、高度协调的过程；淀粉与蔗糖代谢及黄酮生物合成是调控碳水化合物与黄酮积累的核心通路；候选MYB、bHLH与ERF转录因子（如SgbHLH093、SgRAP2-4）可能参与调控上述通路。本研究初步构建了罗汉果离体块茎形态建成背后的代谢重编程框架，为探索药用葫芦科植物贮藏器官发育机制提供了多组学证据，并为罗汉果产量提升与活性成分（尤其是作为天然甜味剂与功能性食品成分的罗汉果苷）的定向选择育种奠定了理论基础。
关键技术方法：以"伯林2号"罗汉果带腋芽茎段为外植体，在含NAA、6-BA、PP333及高浓度蔗糖的1/2 MS培养基上诱导离体块茎，于0—90 d七个时间点取样（每时期3个生物学重复）；采用商用96孔微板试剂盒测定果糖、葡萄糖、蔗糖与淀粉含量；转录组测序（RNA-seq）经fastp质控、HISAT2比对参考基因组、featureCounts计数、DESeq2筛选差异表达基因（DEGs），并行KEGG富集与加权基因共表达网络分析（WGCNA）；广泛靶向代谢组学采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）结合多反应监测（MRM）定量，筛选差异积累代谢物（DAMs）；以UBQ为内参基因进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证。
研究结果：
3.1 罗汉果离体诱导块茎形成的形态发育及淀粉与可溶性糖动态变化：通过连续监测0—90 d形态变化并定量果糖、葡萄糖、蔗糖与淀粉含量，发现0—30 d外植体持续营养生长、基部形成少量增殖缓慢的愈伤组织，无块茎结构；45—60 d出现块茎状结构并逐渐膨大，部分培养物形成气生根；75—90 d块茎持续扩张。果糖与葡萄糖含量均于30 d达峰值后逐渐下降；蔗糖含量自0 d至15 d快速升高，15—75 d维持相对稳定的较高水平，90 d略有峰值；淀粉含量在整个培养期持续升高，0 d最低、90 d最高。
3.2 罗汉果离体诱导块茎形成的代谢组学分析：通过UPLC-MS/MS在七个时间点共检测鉴定1355种代谢物，主成分分析（PCA）显示各阶段明显分离且组内重复紧密聚类、重复性高，0 d样品与后续时间点差异最大。差异积累代谢物（DAMs）分为12类，黄酮类占比最大（27.23%），其次为酚酸类（13.95%）。维恩图显示代谢响应具高度阶段特异性，15 d vs. 0 d比较含最多特有DAMs。层次聚类热图显示大部分代谢物在0 d与15 d丰度高、30—75 d持续下调，另一部分随培养时间逐渐上调；K-means聚类将DAMs分为4类，分别呈持续升高、先升后降、持续下降及仅0—15 d快速升高后持续下降的趋势，表明块茎形成过程中存在显著的时间依赖性代谢转变。
3.3 罗汉果离体诱导块茎形成的转录组学分析：通过转录组测序，PCA显示组内重复紧密聚类、组间明显分离，重复性好且转录差异显著。差异表达基因（DEGs）分析显示90 d vs. 75 d、45 d vs. 30 d与15 d vs. 0 d三组比较DEGs数量最多；维恩图显示7个核心DEGs为所有比较组共享，多数DEGs具阶段特异性，90 d vs. 75 d特有DEGs最多（4901个）。K-means聚类将全部DEGs分为6个亚类，各亚类呈现独特的时序表达趋势，表明存在阶段特异性转录调控。
3.4 罗汉果离体诱导块茎形成中淀粉与蔗糖代谢通路的时间动态：通过热图分析蔗糖与淀粉代谢相关DEGs（包括SUT、SPS、SPP、SUS、UGPase、PGM、AGPS、AGPL、GBSS、SS与SBE）的时序表达，发现SUTs上调以将蔗糖由培养基转运至组织；多数SPS、SPP与SUS基因拷贝在培养早期（15—30 d）与后期（60—75 d）上调，与30—75 d蔗糖含量较高、75—90 d下降相符；UGPase基因表达模式各异并伴随UDP-葡萄糖（UDPG）水平波动；胞质型PGM（cPGM）与质体型PGM（pPGM）基因参与蔗糖—淀粉转换中葡萄糖-1-磷酸（G1P）与葡萄糖-6-磷酸（G6P）的互变；AGPL与AGPS呈异步表达，GBSS在90 d显著诱导，SS于0 d高表达后降低，SBE各亚组分别在早、中、晚期优先表达。相关基因与中间代谢物的协调变化表明蔗糖与淀粉代谢被激活，与块茎形成中蔗糖和淀粉的积累一致。
3.5 罗汉果离体诱导块茎形成中黄酮生物合成的时间动态：通过整合转录组与广泛靶向代谢组数据，分析CHS、CHI、F3H、F3′H、F3′5′H、FLS、LDOX/ANS与ANR等核心基因的时序表达，发现多数上游骨架生物合成基因（CHS、CHI、F3H、FLS）在培养早期（0—30 d）显著上调以驱动黄酮骨架形成；F3′H与F3′5′H于0 d高表达，中期下降但仍维持一定水平，F3′H在90 d重新激活；FLS成员在15—30 d活跃表达并于90 d小幅回升。代谢物方面，柚皮素查尔酮、柚皮素与二氢山奈酚在发育中期积累升高但峰值时间不同（分别为45 d、15 d、15 d），随后逐渐下降；二氢槲皮素、杨梅素与槲皮素-7-O-葡萄糖苷整体呈升高趋势；山奈酚总体下降；槲皮素呈先降后升再降的动态；原花青素A2于15 d达峰后持续下降。结果表明黄酮生物合成通路在块茎发育中被整体激活，黄酮骨架合成代谢物在早中期显著积累以为下游分支提供底物，经羟基化与糖基化修饰的衍生物在中后期上调，而流向花青素分支的代谢通量相对有限，代谢流优先分配至黄酮醇分支。
3.6 罗汉果离体诱导块茎形成相关的MYB、bHLH与ERF转录因子：通过WGCNA构建共表达树状图，模块边界清晰、划分可靠；根据模块—样本关系热图筛选出brown、turquoise与pink三个模块，分别与块茎发育早期、早中期和晚期显著正相关，与淀粉与蔗糖代谢及黄酮生物合成结构基因的分阶段高表达特征相吻合。筛选模块成员度（MM）> 0.8的MYB、bHLH与ERF转录因子，与代表性代谢物构建基因—代谢物共表达网络，发现转录因子间相关性模式差异显著，如SgbHLH093-2与UDP-葡萄糖、二氢山奈酚、柚皮素及原花青素A2呈强显著正相关；多数转录因子与山奈酚及二氢杨梅素-3-O-葡萄糖苷显著正相关，而与二氢槲皮素、杨梅素、蔗糖及果糖-6-磷酸呈负相关。该网络揭示了这些转录因子与淀粉蔗糖代谢及黄酮生物合成相关代谢物之间的潜在关联。
讨论部分总结：本研究通过七个发育时间点（0—90 d）的转录组与广泛靶向代谢组整合分析，初步揭示了罗汉果离体块茎形成中淀粉与蔗糖代谢、黄酮生物合成及候选转录因子调控网络的动态变化。作者指出研究存在局限：缺乏非块茎形成对照组，所有外植体均培养于同一诱导培养基，故所检测的时序分子变化尚不能完全区分块茎特异性调控事件与长期离体培养、高外源蔗糖或组织衰老引起的一般生理响应；外源吸收蔗糖与内源合成蔗糖的相对贡献无法区分，需稳定同位素标记实验；ADP-葡萄糖（ADPG）与二氢杨梅素等中间代谢物未被检测到，可能源于通路代谢通量快速或广泛靶向代谢组学的局限；AGPase全酶活性并非完全由转录水平决定，需翻译后修饰激活。作者认为，早中期淀粉蔗糖代谢与黄酮生物合成基因同步显著上调，表明块茎形成依赖基础碳代谢以维持快速细胞增殖与能量需求，大量抗氧化黄酮合成可能有助于抵御离体培养相关胁迫；晚期以蔗糖向淀粉转化相关的AGPS、GBSS等关键基因维持高表达，而CHS、F3H等黄酮核心骨架基因逐渐下降，提示初级贮藏代谢与黄酮次生代谢间存在碳骨架的部分分配；糖基化修饰可提高黄酮稳定性与生物活性。MYB、bHLH与ERF为块茎作物贮藏器官形态建成、碳水化合物代谢重编程与黄酮生物合成的核心转录因子家族，SgbHLH093、SgMYB306、SgERFC3、SgRAP2-7与SgRAP2-4等候选调控因子与相关代谢物关联；qRT-PCR验证结果与转录组数据高度一致（Pearson相关系数0.871，p = 5.03 × 10
?12），支持转录组数据的可靠性，SgRAP2-4在两方法间存在轻微差异。针对罗汉果苷生物合成，研究人员从转录组数据中检索到SgSQE、SgCDS、SgCYP87D18与SgUGT74AC1等基因，SgCDS与SgCYP87D18在0 d与90 d表达较高、中期下降，但罗汉果苷通路中间代谢物未被鉴定，提示其遗传程序可能在分子水平被激活，产物积累或需更长时间。局限性还包括离体培养体系与田间自然条件差异显著，多组学整合仅揭示统计相关而非因果调控关系，候选转录因子作用缺乏酵母单杂交、双荧光素酶报告及基因过表达或沉默等直接分子证据，不能断定这些分子事件直接驱动块茎发育。后续将开展核心候选转录因子基因的体内外功能表征，并将离体块茎移栽田间比较生长速率与抗病虫性，同时深入研究晚期显著上调的罗汉果苷生物合成基因。
研究结论翻译：本研究系统刻画了罗汉果离体诱导块茎形成在七个连续发育阶段的动态图谱。结果揭示，罗汉果离体诱导块茎形成伴随早期发育阶段包括黄酮在内的防御性次生代谢物合成以抵御离体胁迫，同时大量碳通量被导向蔗糖与淀粉等贮藏物质的生物合成。候选MYB、bHLH与ERF转录因子（如SgbHLH093与SgRAP2-4）可能调控块茎发育过程中的淀粉与蔗糖代谢及黄酮生物合成。综上，本研究初步构建了罗汉果离体块茎形态建成背后的代谢重编程框架，为探索药用葫芦科植物贮藏器官发育机制提供了多组学证据，并为罗汉果产量提升与活性成分（尤其是作为天然甜味剂与功能性食品成分的罗汉果苷）的定向选择育种奠定了坚实的理论基础。
