《Plants》：Investigation of the Physiological and Biochemical Effects of Brassinosteroid and Nitric Oxide in Two Wheat Varieties with Different Drought Tolerance
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干旱通过增加植物体内活性氧（ROS）的积累引发氧化胁迫，从而导致面包小麦（Triticum aestivum L.）产量下降。另一方面，已知一氧化氮（NO）和油菜素甾醇（BRs）可通过多种信号转导途径维持干旱胁迫下小麦的细胞稳态。本研究聚焦于NO（硝普钠，SN
干旱通过增加植物体内活性氧（ROS）的积累引发氧化胁迫，从而导致面包小麦（Triticum aestivum L.）产量下降。另一方面，已知一氧化氮（NO）和油菜素甾醇（BRs）可通过多种信号转导途径维持干旱胁迫下小麦的细胞稳态。本研究聚焦于NO（硝普钠，SNP）与BR（表油菜素内酯，EBL）单独及联合处理对两种耐旱性不同小麦品种在聚乙二醇（PEG）诱导及水分亏缺诱导的干旱胁迫下生理生化参数的影响。干旱胁迫降低了干旱敏感品种Kenanbey中抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）和过氧化物酶（POX）活性，而提高了耐旱品种NKü Lider中超氧化物歧化酶（SOD）、GR、APX和CAT活性。外源SNP和EBL处理有效缓解了干旱诱导的膜损伤和氧化胁迫，使两个品种的电解质渗漏（EL）、脂质过氧化（TBARS）和ROS积累显著降低。在NKü Lider中，无论在PEG诱导的渗透胁迫还是水分亏缺条件下，与单独处理相比，SNP与EBL联合处理均提高了根长（RL）、生物量、干重（DW）和SOD同工酶条带强度，同时降低了电解质渗漏（EL）。在Kenanbey品种中，水分亏缺条件下联合处理改善了生物量、SPAD值、CAT和POX活性以及SOD同工酶条带强度，同时降低了EL。此外，两种干旱处理下大幅降低的SPAD和含水量在SNP和EBL单独及联合处理后均恢复至对照植株水平。这些发现凸显了NO和BR处理作为改善小麦品种耐旱相关生理生化响应的潜在策略的价值，并为开发小麦幼苗耐旱叶面调节剂提供了实验依据。
**研究背景** 气候变化、全球气温升高和水资源短缺是威胁农业生产的重要环境问题，干旱胁迫被认为是负面影响植物生长和产量最为突出的非生物胁迫因子之一。干旱导致植物水势下降、细胞膨压紊乱、光合能力降低及代谢过程受抑，最终使植株生长、发育和作物产量显著下降。小麦（Triticum aestivum L.）是世界主要粮食作物之一，干旱造成的小麦减产对全球粮食安全构成重大威胁。细胞含水量下降的重要后果之一是光合与呼吸途径中电子传递方向的错位，进而产生活性氧（ROS）；干旱胁迫的严重程度和持续时间导致ROS浓度过度升高，超氧阴离子（O2•?）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（•OH）和单线态氧（1O2）等过量积累引起细胞水平氧化损伤，膜脂过氧化、蛋白氧化、色素损失和酶抑制随之加剧，细胞膜通透性升高。植物可通过酶促与非酶促抗氧化防御系统缓解氧化胁迫和亚硝化胁迫的有害影响，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）和过氧化物酶（POX）在ROS解毒中发挥基础性作用。近年来提高植物胁迫耐性的研究聚焦于信号分子和植物生长调节剂。一氧化氮（NO）作为重要信号分子参与气孔关闭、离子稳态调节、抗氧化酶活性增强及细胞氧化还原平衡维持等过程；油菜素甾醇（BRs）参与细胞分裂、伸长、光合、衰老和胁迫响应等多种生理过程，其中24-表油菜素内酯（EBL）可维持膜稳定性并保护光合能力。已有研究表明，在水分胁迫下辣椒中BR诱导的NO产生有助于抗氧化防御和耐性提高，且NO与BR信号途径在调控植物生长发育中存在互作；然而，NO与BR的互作是否参与小麦干旱响应，尤其在二者联合供应时，尚缺乏充分认识。NO和BRs对干旱胁迫的独立效应已在众多研究中报道，但二者联合处理下小麦生理生化响应的数据仍然不足。基于此，本研究以耐旱品种NKü Lider和干旱敏感品种Kenanbey为材料，探究SNP与EBL单独及联合处理对小麦耐旱性的生理生化效应。研究人员提出三点假设：（i）叶面预喷施SNP和EBL可缓解干旱诱导的幼苗生长抑制和氧化损伤；（ii）与单独处理相比，SNP + EBL联合处理对抗氧化防御可能具有互补效应，但效应大小可能因参数而异；（iii）两个品种间以及PEG诱导渗透胁迫与水分亏缺间的生理生化响应可能存在差异。为检验上述假设，研究人员评估了生长相关性状、植株水分状况、细胞损伤及抗氧化防御（包括关键抗氧化酶活性）。试验采用15%（w/v）PEG-6000代表可控条件下的中度渗透胁迫，同时采用停止供应营养液模拟渐进性水分亏缺，二者被视为对比性实验方法而非确切界定的干旱严重度水平；由于未独立量化水分亏缺严重度，研究人员重点比较了耐旱与干旱敏感品种在可控渗透胁迫和水分亏缺下的响应差异。
**研究方法** 研究人员以耐旱性不同的两个面包小麦品种NKü Lider和Kenanbey为材料，种子经5%次氯酸钠（NaOCl）表面消毒后于无菌培养皿萌发，随后移入含珍珠岩的3 L盆中，每盆20株，于25 ± 2 °C、16 h光照/8 h黑暗、相对湿度70–75%、光强300 μmol m?2 s?1的培养箱中培养，浇灌100% Hoagland营养液；每个品种×处理×水分状态组合设三个独立盆，每盆取3株，以盆为生物学实验单位，3次生物学重复（n = 3）。21日龄幼苗叶面喷施200 μM SNP（每盆25 mL）和0.05 mg L?1 EBL（每盆25 mL），并设二者联合处理（200 μM SNP + 0.05 mg L?1 EBL）。水分处理设良好供水对照、营养液中添加15%（w/v）PEG-6000诱导的中度渗透胁迫（渗透势?0.30 MPa，按Michel和Kaufmann法计算）以及停止供应营养液造成的渐进性水分亏缺三种 regime。胁迫第7天取样，测定株高、根长、生物量、干重、相对含水量（RWC）、SPAD值、脂质过氧化（TBARS）、H2O2含量、电解质渗漏（EL）、CAT、POX、APX、GR活性及SOD和CAT同工酶谱，并进行H2O2与O2•?组织化学定位。数据采用SPSS 27进行三因素方差分析（品种×水分 regime×处理），Tukey HSD法进行事后多重比较（p < 0.05），并以Python 3.10.0进行主成分分析（PCA）和Pearson相关分析。
**研究结果**
2.1 干旱胁迫对生长参数的影响：干旱胁迫抑制了两个品种的幼苗发育。NKü Lider在PEG下株高不变，水分亏缺下降低10%，而SNP、EBL及SNP + EBL处理在水分亏缺下分别使株高增加13%、3%和9%；Kenanbey在PEG和水分亏缺下株高分别降低3%和8%，水分亏缺下三种处理分别使株高增加6%、7%和4%。Kenanbey在水分亏缺下根长显著降低20%，SNP + EBL处理使两个品种根长均显著增加17%，Kenanbey中EBL处理亦显著增加18%。NKü Lider在PEG和水分亏缺下生物量分别降低17%和32%，SNP + EBL联合处理使三个水分组生物量分别增加8%、55%和39%；Kenanbey在PEG和水分亏缺下生物量分别降低10%和27%，PEG下SNP + EBL使生物量增加12%，水分亏缺下SNP、EBL和SNP + EBL分别增加11%、23%和18%。NKü Lider在PEG和水分亏缺下干重分别降低21%和36%，联合处理分别使干重增加38%和44%；Kenanbey干重分别降低7%和21%，水分亏缺下SNP、EBL和SNP + EBL分别使干重增加14%、32%和18%。上述生物量与干重的降低及联合处理在NKü Lider中的提升、EBL和SNP + EBL在Kenanbey水分亏缺下的改善均具统计学显著性（p < 0.05）。
2.2 相对含水量与SPAD值：干旱胁迫降低两个品种RWC，NKü Lider在PEG和水分亏缺下分别下降2和10个百分点，Kenanbey分别下降7和12个百分点；PEG下各处理对RWC无显著影响（p > 0.05），而水分亏缺下SNP、EBL和SNP + EBL使NKü Lider RWC提高约7个百分点、Kenanbey提高9、8和9个百分点（p < 0.05），恢复至接近良好供水对照水平。SPAD值在NKü Lider的PEG和水分亏缺下分别降低13%和33%，Kenanbey分别降低16%和35%；PEG下SNP、EBL和SNP + EBL使NKü Lider SPAD值分别提高24%、13%和24%，水分亏缺下分别提高50%、41%和47%；Kenanbey在PEG下三种处理均提高约23%，水分亏缺下分别提高41%、26%和53%。
2.3 氧化胁迫标志物：干旱胁迫提高两个品种H2O2含量、TBARS含量和EL。NKü Lider在PEG和水分亏缺下TBARS分别增加16%和9%，SNP、EBL和SNP + EBL在PEG下使TBARS降低40%、41%和61%，水分亏缺下降低20%、32%和16%；Kenanbey TBARS分别增加9%和60%，PEG下三种处理降低32%、12%和5%，水分亏缺下降低65%、68%和48%。NKü Lider中PEG和水分亏缺未改变H2O2含量，PEG下三种处理使H2O2降低6%、21%和19%，水分亏缺下降低38%、36%和26%；Kenanbey水分亏缺下H2O2增加18%，三种处理使其降低25%、13%和14%。NKü Lider在PEG和水分亏缺下EL分别增加57%和63%，三种处理在PEG下使EL降低12%、10%和22%，水分亏缺下降低11%、9%和17%；Kenanbey EL分别增加24%和18%，PEG下降低19%、15%和14%，水分亏缺下降低18%、20%和21%。
2.4 抗氧化酶活性：与各自干旱胁迫处理相比，SNP和EBL单独及联合处理均刺激抗氧化酶活性升高。NKü Lider中SNP、EBL和SNP + EBL使CAT活性分别提高26%、48%和55%，PEG下分别提高37%、30%和24%，水分亏缺下提高87%、34%和21%；Kenanbey中三种处理使CAT活性分别提高83%、92%和97%，PEG下提高70%、130%和159%，水分亏缺下提高115%、128%和154%。NKü Lider中PEG下POX活性降低30%而水分亏缺下升高25%，PEG下SNP使POX提高86%而EBL和SNP + EBL分别降低8%和20%，水分亏缺下SNP提高25%而SNP + EBL降低29%；Kenanbey中PEG和水分亏缺下POX分别降低43%和68%，PEG下SNP和SNP + EBL分别提高22%和27%，水分亏缺下仅SNP + EBL提高30%。NKü Lider中PEG和水分亏缺下APX分别提高42%和84%，SNP、EBL和SNP + EBL在对照组分别提高16%、51%和41%，PEG下提高12%、17%和64%，水分亏缺下提高10%、21%和13%；Kenanbey中PEG下APX提高87%而水分亏缺下降低33%，PEG下三种处理提高61%、36%和17%，水分亏缺下提高184%、153%和128%。NKü Lider中PEG和水分亏缺下GR分别提高36%和61%，PEG下EBL使GR降低11%而SNP和SNP + EBL分别提高7%和5%，水分亏缺下三种处理提高20%、28%和18%；Kenanbey中PEG和水分亏缺下GR分别降低15%和53%，PEG下三种处理提高22%、17%和9%，水分亏缺下提高84%、44%和21%。
2.5 同工酶谱：NKü Lider中对照处理SOD同工酶强度在PEG下提高11%、水分亏缺下降低23%；良好供水下SNP、EBL和SNP + EBL使强度提高6%、21%和40%，PEG下提高7%、15%和29%，水分亏缺下提高52%、64%和68%。Kenanbey中对照处理SOD同工酶强度在PEG下提高79%、水分亏缺下降低28%；良好供水下三种处理提高36%、84%和100%，PEG下SNP降低10%而EBL和SNP + EBL提高8%和4%，水分亏缺下提高28%、69%和66%。CAT同工酶（CAT1和CAT2）谱在品种和干旱处理间存在差异：NKü Lider中CAT同工酶条带强度在PEG和水分亏缺下分别提高16%和27%，PEG下SNP和SNP + EBL提高15%和17%，水分亏缺下三种处理提高18%、10%和6%；Kenanbey中条带强度在PEG和水分亏缺下分别降低11%和17%，水分亏缺下三种处理提高70%、45%和25%。
2.6 组织化学分析：NBT染色显示干旱下叶片O2•?积累增加且Kenanbey强于NKü Lider，联合SNP + EBL处理降低染色强度；DAB染色显示水分亏缺下两个品种叶片H2O2积累明显且定位于叶尖，SNP + EBL组H2O2水平与良好供水对照相近。PCA前两个主成分解释总变异的44.47%（PC1为27.79%，PC2为16.68%），耐旱品种NKü Lider与敏感品种Kenanbey明显分离，RWC、SPAD、RL、SL、DW和生物量沿PC1正轴聚集，H2O2、TBARS和EL沿PC1负轴载荷较重，Kenanbey水分亏缺组孤立于左下象限，NKü Lider在PEG和水分亏缺联合SNP、EBL及SNP + EBL处理下与CAT、SODiso、CATiso、POX、APX和GR等抗氧化向量聚集于上部区域，三种处理使Kenanbey由胁迫易感区向中央坐标平面移动。Pearson相关分析显示生物量与干重（r = 0.74）、SPAD与RWC（r = 0.62）、GR与POX（r = 0.58）呈强正相关，H2O2与CAT（r = ?0.51）呈负相关，TBARS与APX（r = ?0.48）和CAT（r = ?0.47）呈负相关。
**讨论与结论** 讨论部分指出，两个品种均受PEG诱导渗透胁迫和水分亏缺的负面影响，SNP和EBL缓解了其中许多效应，但响应因性状、品种和胁迫 regime而异，联合处理并非在所有参数上均优于单独处理。耐性并未在各性状上均匀表达：水分亏缺下NKü Lider生物量和干重的比例降幅大于Kenanbey，而Kenanbey中根长抑制和脂质过氧化更为突出。外源处理部分抵消了这些生长抑制，NKü Lider中联合处理显著提高PEG和水分亏缺下的干重，Kenanbey水分亏缺下EBL单独处理对干重的提升最大。SPAD值下降幅度与品种耐旱性相关，PEG下三种处理在各品种内效果相近，水分亏缺下联合处理在Kenanbey中增幅最大；PEG中度胁迫下处理对RWC无显著影响，而水分亏缺下所有处理均显著恢复叶片水分状况，这可能有助于Kenanbey的较好生长。研究人员指出所用SNP浓度（200 μM）处于既往小麦研究应用范围（100–200 μM）之内。干旱诱导的氧化胁迫增加脂质过氧化和EL，SNP和EBL处理显著减轻脂质过氧化和EL，但联合处理的保护优势具有性状和胁迫特异性。分光光度法测定的H2O2在NKü Lider中未变化、仅在Kenanbey水分亏缺下升高，而DAB染色显示两个品种水分亏缺下叶尖H2O2积累，提示局部增加可能在整叶提取物中被稀释；NBT染色在处理的叶片中较弱，提示O2•?积累减少，但该定性证据仅作为支持性证据解读；EL和TBARS的降低与抗氧化响应增强相伴，可能有助于膜保护，但该关联不能证明因果关系。SOD将O2•?转化为H2O2，后者由CAT、APX和POX解毒；本研究中干旱诱导的抗氧化酶活性和同工酶谱变化呈现明显的品种和胁迫依赖性，PEG诱导渗透胁迫刺激SOD同工酶条带强度而渐进性水分亏缺在两个品种中均抑制之，外源SNP和EBL处理有效抵消了这种下降；GR活性在NKü Lider两种胁迫下均升高，而在Kenanbey中严重受抑且外源SNP显著恢复其活性，这些对比性响应可能反映两个品种在氧化胁迫下调控抗坏血酸–谷胱甘肽循环能力的差异。水分亏缺下Kenanbey的H2O2积累和TBARS水平均显著增加，而NKü Lider维持较低的基线氧化胁迫和有限的脂质过氧化，这一生理差异与既往关于耐旱小麦品种维持更优氧化还原缓冲能力、积累较低MDA和H2O2的报道一致。外源SNP和EBL在两种水分 regime下均有效抑制TBARS和H2O2积累，与已报道的NO和BR介导的细胞膜脱水保护作用一致。机制上，NO作为自由基清除剂并与BRs协同上调核心清除酶（SOD、CAT、APX和GR），从而保护抗坏血酸–谷胱甘肽循环、维护膜完整性（降低EL）并减轻严重水分亏缺下的细胞损伤；SNP与EBL的互补效应可能涉及NO与BR相关信号的互作，ROS本身是植物适应非生物胁迫的多维调节因子，处理诱导的ROS代谢变化可能反馈影响NO和激素信号。据此研究人员提出两点假设：（i）EBL刺激内源NO产生，NO作用于BR下游调节抗氧化酶的表达或活性；（ii）NO和BR协同调节气孔运动、根系生长和渗透调节物质积累，从而帮助维持叶片水分状况；这些假设与本研究在水分亏缺下观察到的抗氧化响应增强、RWC部分恢复以及H2O2、TBARS和EL降低相一致。PCA揭示了两个品种生理生化响应的多变量差异，Pearson相关分析进一步显示生长参数间的正相关以及氧化胁迫指标与抗氧化酶活性间的负相关；NKü Lider与Kenanbey之间的差异可能主要源于所考察的幼苗期及两品种固有的耐性阈值。从实践角度看，最值得进一步验证的效应是水分亏缺下RWC和SPAD值的部分恢复、膜损伤（EL和TBARS）的减轻及抗氧化防御的调节，而生长性状的效应随品种和胁迫 regime而异。本实验每种化合物仅测试单一剂量、对21日龄幼苗施用一次、可控条件下胁迫7天，未评估籽粒产量、生殖期干旱、重复施用、田间表现和基质水分状态，因此无法推断最佳剂量或施用方案；尚需剂量–响应、施用时期和田间研究，结合分子分析和数字建模，以确立农艺适用性。在本实验条件下，叶面施用200 μM SNP + 0.05 mg L?1 EBL减轻了两个小麦品种幼苗的干旱诱导氧化损伤，在干旱敏感品种中改善更为明显，但其田间应用潜力仍需验证。研究结论部分指出，干旱胁迫引起小麦品种显著的生理生化改变，外源SNP和EBL处理部分缓解了干旱胁迫的某些不利影响，可能通过调节抗氧化防御响应和ROS积累实现；SNP + EBL联合处理似可提供互补性保护效应，尤其在干旱敏感品种中；这些发现提示NO和BR处理可能有助于改善小麦品种耐旱相关的生理生化响应。
