醇脱氢酶活性与种子渗出液电导率作为大豆萌发期耐涝性潜在指标

《Plants》：Alcohol Dehydrogenase Activity and Electrical Conductivity of Seed Exudates as Potential Indicators of Flooding Tolerance in Soybean Groups During the Germination Stage

　　

涝渍胁迫是限制大豆（Glycine max (L.) Merr.）生长发育的非生物胁迫之一，尤其在种子萌发阶段。土壤中过多的水分消耗氧气，导致萌发失败以及植株群体和建成的参差不齐。以往研究已在田间及多个生育期评估了涝渍胁迫对萌发的影响，但不同耐性水平大豆在涝渍胁迫下萌发的响应尚不清楚。本研究在实验室进行种子浸泡以模拟涝渍胁迫，选用按种子浸泡耐受性（耐受、中等、敏感）分组的15个大豆品种，每组暴露于种子浸泡12、24、36和48 h。分析了吸水曲线、电导率（EC）、醇脱氢酶活性（ADH）和乙醇含量。结果表明，子叶组织中的ADH活性及EC在组间存在差异。中等和敏感组子叶组织中的ADH在12 h被诱导，而耐受组在胁迫下于48 h被诱导。种子渗出液的间隔EC测定表明，耐受品种的电导率低于中等和敏感组。综上，48 h时子叶组织ADH活性与EC可作为区分萌发期耐涝组的间接生理性状。KKU–SB052被推荐为大豆育种计划的天然遗传资源，其在长时间涝渍后表现出高ADH活性并在涝渍胁迫下维持细胞膜完整性。

**研究背景与问题** 大豆（Glycine max (L.) Merr.）普遍对涝渍胁迫敏感，气候变化导致强降水频率上升，预计到2030年强降雨增加30%，涝渍可使大豆生产力降低约16%，造成农民数十亿美元损失。大豆生产集中于温带地区，但热带地区为满足发展中地区需求也在扩大种植。涝渍显著影响大豆生长与产量，如中国黄淮海平原和印度尼西亚的易涝区，以及泰国水稻–大豆轮作或淹水稻田种植体系，其主要挑战是自然排水不良和临时淹水。农户实践观察显示，农户对稻田灌水保持土表约2–3 cm水深直至土壤完全饱和，随后播种大豆种子并留置2–3 h或更长时间后排水，导致该栽培体系发芽率降低，需提高播种量以维持幼苗群体。已有报道，大豆种子淹水1天（24 h）发芽率降低20%，淹水2–3天后发芽率继续下降至50–70%；泰国商业品种SJ5和CM60浸水2 h后发芽率分别为79.5%和67.0%；在100%土壤持水量下播种未观察到发芽。涝渍降低氧可用性（hypoxia，缺氧），土壤长时间淹水可能导致无氧（anoxia，厌氧）。氧限制损害大气与种皮间的气体交换，降低ATP合成，种子能量危机源于缺氧。发酵途径不仅在正常氧水平下发生，也快速响应低氧水平被诱导以供应能量维持生存，维持发酵代谢是厌氧条件下的主要途径。醇脱氢酶（ADH，EC 1.1.1.1）作为发酵酶，参与乙醛和乙醇生成，同时再生NAD+供糖酵解。已有研究报道Adh基因在厌氧条件下表达且主要在根中；Komatsu等对大豆转录组和蛋白质组研究发现，涝渍实验中与酒精发酵相关的基因在12 h后较对照显著上调超过10,000倍；转基因大豆中导入的GmADH2基因诱导糖酵解和酒精发酵，从而改善涝渍胁迫下萌发。此外，活性氧（ROS）、乙醇和乙醛等有毒代谢物积累可导致细胞损伤并加速种子劣变；已有报道大豆和草坪草萌发在酒精存在下受抑制。因此，近期研究证明ADH活性变化在耐涝性中起重要作用。理解萌发期耐涝机制对改善大豆生产和培育适于淹水地区的品种很重要。尽管ADH在耐涝性中的作用已在营养器官中记载，但其在厌氧条件下种子萌发中的功能仍知之甚少。以往多数研究仅比较耐受与敏感基因型而未纳入中等组；且同一耐受组内个体基因型可能依靠不同生存机制，组内多样性很大程度上未被探索。本研究通过种子浸泡模拟涝渍胁迫，考察15个大豆基因型的吸水模式、电导率、ADH活性和乙醇积累，按三个耐受组在多个时间间隔分类。研究假设耐受大豆组较其他组表现出显著更高的ADH活性和更低的电导率；每组含5个品种，以检验涝渍下萌发是否源于共享的耐性机制。研究目的是阐明实验室种子浸泡模拟涝渍胁迫下大豆的生理响应，所得知识将加深对大豆各组耐涝性的理解，并为大豆育种计划提供天然遗传资源。

**主要技术方法** 研究采用完全随机设计（CRD），3次重复，以种子浸泡模拟涝渍。所用74份大豆种质来自泰国孔敬大学（KKU）可持续农业植物育种研究中心，原始材料于2014年从泰国DOA和NIAS世界大豆核心种质库获得并在KKU保存，本地编号为KKU–SBxxx，原始品种/品系名称及登录信息见补充表S2；种质于2022年12月至2023年3月在农艺大田作物站种植，收获种子经晒干除湿。预筛选每品种3次重复、每重复25粒，在含高于种子表面3 cm蒸馏水的100 mL烧杯中浸泡24 h，随后采用纸间法在光照黑暗交替（12 h）、温度25和30 °C、70%湿度下萌发，播种后8天记录数据；耐性分级阈值定义：耐受（≥70%）、中等耐受（40–69%）、敏感（≤39%），每组选5个品种，选择标准基于与泰国商业品种SJ5和CM60相似的种子大小和黄色种皮以减少其他因素干扰（KKU-SB052除外，其发芽值高但种子小、种皮绿色）。实验对15个品种在浸泡12、24、36和48 h后取样。种子吸水曲线按修改方法称量浸泡前及1、2、4、6、8、10、12、24、36 h和48 h结束时的种子重量，以相对重量（%）表示，质量增量（%）= [(Mt ? Mi)/Mi] × 100。电导率测定收集不同浸泡时间（12、24、36、48 h）的种子渗出液，用Mettler–Toledo电导率仪直接测定，单位μs/cm。ADH活性采用Fukao等的方法并修改反应体积，分别取50 mg子叶和胚轴组织，于预冷研钵中加入0.4 mL提取缓冲液（含100 mM Tris-HCl pH 9.0、20 mM MgCl2、0.1%（v/v）2-巯基乙醇）匀浆，离心收集上清；反应体系（终体积2 mL）含100 μL提取液、50 mM Tris-HCl（pH 9.0）和1 mM NAD+，加入100 μL乙醇启动反应，于340 nm监测NAD+还原2 min（E = 6.22 mM?1 cm?1）；蛋白质按Bradford（1976）法于595 nm测定，以牛血清白蛋白为标准。乙醇测定采用Fukao等的方法，取约50 mg种子组织与预冷0.2 mL 5 M HClO4研磨，4 °C、16,000× g离心20 min，取上清100 μL用0.25 mL 1 M K2CO3中和，离心去除白色沉淀；组织上清和渗出液100 μL用于乙醇测定（900 μL体系含100 mM Tris-HCl pH 9.0、0.6 mM NAD+和40单位ADH），25 °C孵育1 h，于340 nm监测，以乙醇标准曲线计算含量。统计分析对各参数采用单因素方差分析（ANOVA）检验品种间显著差异，均值比较采用最小显著差数法（LSD）在p ≤ 0.05水平；Pearson相关分析评估各涝渍时期性状间关系；使用Statistix 10软件；层次聚类分析使用Origin 2022基于多种性状对品种分组，数据经重标定法（0–1）归一化，采用Pearson相关距离类型和最远邻聚类。

**研究结果** 2.1 种子吸水曲线与电导率：结果表明种子吸胀后1–6 h发生快速吸水，总体上组间吸水曲线无差异；4 h后质量增量较初始重量增加约100%，表明水快速进入渗透性种皮从而增加种皮体积；6 h后吸水曲线进入平稳期或略增，此时发生生理活动。电导率（EC）由各样本种子渗出液测定，该性状可用于依据发芽区分耐涝组。耐受组EC在涝渍间隔内较中等和敏感组倾向轻微增加；耐受组12 h时EC值在6.96至15.84 μs cm?1之间；KKU–SB052浸水48 h后EC显著增加，该品种在组内和组间比较均表现旺盛。中等组电导率随胁迫暴露时间延长逐渐增加，胁迫后36至48 h观察到EC增加；SK1的EC较其组内其他品种和耐受组显著增加。敏感组EC增加高于中等和耐受组，浸水24 h后观察到敏感组EC值显著增加；SK2在所有品种中EC值最高。尽管RJM归入敏感组，其12–48 h EC值变化略增（11.75–26.25 μs cm?1），数值接近KKU–SB009（12.54–26.84 μs cm?1）。2.2 醇脱氢酶活性（ADH）：子叶组织中，浸水12 h后所有大豆组ADH活性均增加；敏感组ADH活性倾向增加，在同一胁迫暴露时期内较其他组高4–5倍；SK2观察到最高ADH活性，为181.47 unit mg?1 protein；相反，耐受和中等组活性约为20 unit mg?1 protein，提示ADH活性在不同胁迫时长后响应模式不同。24–36 h ADH活性波动，无法区分组间；有趣的是，耐受和中等组活性在浸水48 h内持续增加，中等组ADH范围为20至95 units mg?1 protein，CM60是唯一ADH活性下降的品种（21.44 units mg?1 protein）；耐受组所有品种ADH活性在48 h内被诱导，而其他组则未。总体上，胚组织中ADH酶活性在胁迫暴露期间波动；24 h时SJ5在耐受组中活性最高，而敏感组ADH活性在胁迫后48 h倾向下降，但SJ1例外，其ADH活性增加。比较显示，两种组织中ADH活性对不同时长浸水响应不同；子叶组织ADH在贡献大豆生存中起重要作用，尤其该酶在敏感组浸水12 h后被诱导随后下降，而在耐受组于48 h被诱导。2.3 乙醇积累：种子渗出液和组织中测定的乙醇含量表明，乙醇水平无法有效参数化以区分大豆耐性组，因各组数值重叠；此外，所有大豆组组织乙醇积累在48 h较此前时间点急剧增加；有趣的是，归入耐受组的KKU–SB052较同组其他基因型向种子渗出液释放更少乙醇。2.4 层次聚类：采用层次热图解释大豆对不同时期涝渍胁迫和品种的响应模式；层次聚类基于预研究的发芽率进行；总体聚类显示组内生理响应存在差异；本研究结果显示24和48 h的EC、子叶ADH活性和种子渗出液酒精含量存在差异，因此这些性状用于进一步层次聚类分析；聚类分析提供生理模式的解释，图亦显示尽管组内发芽率高，但每个品种在浸水期间采用不同响应以生存。垂直聚类按测定性状分组，水平聚类按品种分组，聚类结果分为四个不同模式。第一聚类分为两个亚聚类，耐受组KKU–SB002和KKU–SB052显示相似模式，具有高发芽和48 h高ADH活性及24 h低EC；KKU–SB052种子渗出液中乙醇尤其低，可解释为该品种在48 h后响应涝渍胁迫，提示耐受组萌发潜力与膜维持和浸水期间ADH活性诱导延迟相关。第二聚类KKU–SB023、SJ5和KKU–SB009品种在浸水24 h较KKU–SB002和KKU–SB052更快响应胁迫，EC和乙醇积累轻微增加；中等和敏感组显示相似模式。第三聚类包括中等和敏感品种，分为两个亚聚类；第一亚聚类为CM6、SJ2、SJ1和SK1，共享低ADH活性伴随EC和乙醇积累增加的响应；第二亚聚类包括RJM、KKU–SB57、CM60和KKU–SB22，除EC和乙醇积累外与第一亚聚类相似。最后，聚类LP和SK2倾向在24 h增加ADH活性并伴高EC和乙醇。聚类结果提示EC和ADH活性可与耐受组区分，整体上这些生理性状可作为基于响应和发芽对大豆基因型分类的潜在指标。

**讨论与结论** 讨论部分指出，本研究所有大豆组吸水模式在早期快速增加，随后随吸胀达到平衡而进入平台期；耐受组内基因型间吸水曲线变异低，表明这些基因型在涝渍条件下有效吸水；相反，中等和敏感组组内吸水曲线变异较大，SJ1在浸水下质量增量最低，表明长时间淹水严重破坏敏感基因型的吸水和萌发。研究结果表明种子吸胀期间溶质渗漏到周围介质中普遍发生，该渗漏反映膜损伤程度；耐受组浸水期间EC仅轻微增加，提示耐受基因型在胁迫下能维持膜完整性，这与Zhou等和Sharmin等报道EC与发芽率负相关一致。Koizumi等研究种皮在吸胀大豆种子中的作用，发现干种子吸胀前去除种皮时子叶在吸水1–5 h内严重受损；然而敏感组部分大豆品种虽发芽，但产生较高比例异常、矮化幼苗，且种皮与子叶组织分离，这些结构异常可能造成浸水下发芽降低。本研究结果提示涝渍胁迫下发芽率差异与吸胀期间EC负相关；先前在田豌豆的研究也报道电导率与重组自交系群体耐涝性密切相关；种皮完整性可有效用于豌豆和苏丹草耐涝性的间接选择，但吸胀期间种皮与子叶区之间内部结构和水运动需进一步研究。涝渍胁迫导致大豆缺氧并抑制呼吸，该条件不仅抑制甘油三酯转化为糖、影响种子贮藏物质动员，还抑制种子吸胀期间赤霉素生物合成。本研究用种子浸泡模拟涝渍，结果显示耐受组子叶组织ADH活性在浸水48 h上调，而敏感组在暴露后12 h更早响应；中等组ADH活性也在胁迫后12 h被诱导，但值低于敏感组；相反，敏感大豆组的早期响应暗示敏感基因型暴露于浸水。Rizal和Karki研究中有类似趋势，对涝渍胁迫敏感的品种Tamahomare在胁迫暴露6 h期间显示较高ADH活性，而耐涝品种Peking在同一暴露期显示较低ADH活性。ADH活性增加有助于生存并通过发酵碳水化合物维持无氧条件下ATP产生以克服能量短缺；敏感大豆组ADH活性早期诱导提示其改变代谢，可能参与厌氧代谢。本研究中胚轴ADH活性组间模式无差异，提示子叶组织ADH在贡献种子浸水下生存中起重要作用而非胚组织。种子萌发期间，早期吸胀发生呼吸为萌发产生能量，种子养分从贮藏库动员；根据本研究结果，子叶贮藏组织中ADH改善有助于更高萌发表现。涝渍胁迫期间，ADH通过将乙醛还原为乙醇再生NAD+；缺氧期间产生的有毒物质导致种子劣变。先前对大豆cv. Essex的研究发现厌氧条件下乙醛和乙醇产生增加，且在劣变种子胚轴中观察到低氧吸收率。本研究中乙醇不能区分大豆组；植物细胞中积累的乙醇被视为有毒物质并可能干扰萌发，该发现与不同活力大豆的乙醇测试一致。先前研究报道EC与种子呼吸的关联，观察到高活力种子释放乙醇较低活力种子慢。本研究中各大豆组EC值在不同时期胁迫暴露时每小时增加存在差异，随其耐受浸水能力而变化；结果提示敏感组大豆膜完整性易受损，尽管乙醇含量与中等和耐受组相同。RJM是敏感组中唯一显示最低EC的品种，该品种乙醇积累和子叶组织ADH活性倾向增加，暗示其他生理响应可能有助于浸水下生存，应进一步研究有氧代谢。此外，KKU–SB052响应涝渍与其他品种不同可能源于其种子大小和种皮颜色；小种子被认为在饱和土壤中较大种子更具适应性，因其表面积与体积比更大，允许水从种皮向胚扩散更快。本研究提出的耐受大豆组耐涝可能机制为：种子浸水期间触发若干生理响应；过量乙醇存在损害种子并降低活力，结果细胞膜完整性受损导致种子渗出液电导率升高；然而厌氧代谢的替代途径被激活，子叶组织ADH被诱导通过糖酵解途径再生NAD+为萌发供能；本研究中KKU–SB052在涝渍胁迫下显示高发芽率、低乙醇产生和电导率，以及长时间涝渍胁迫后高ADH活性；而中等大豆组可能在浸水36 h期间以较低响应水平使用这些机制。结论部分译为：大豆种子在涝渍胁迫下改变代谢，中等和敏感组子叶组织ADH在12–24 h增加；相反，耐受组ADH在48 h后被诱导。长时间胁迫暴露增加种子损伤，表现为种子渗出液电导率升高和组织乙醇积累。ADH活性在萌发期间持续产生能量中起重要作用。耐受大豆组维持高发芽率，表现为渗出液乙醇积累低、膜完整性保持和48 h ADH活性维持；而敏感组显示ADH活性早期响应和更高电导率。因此，子叶组织ADH活性和电导率应作为评价耐涝性的标准。KKU–SB052品种被推荐作为天然遗传来源，用于大豆育种计划中转移这些性状的潜在杂交亲本。此外，本研究结果可作为评估浸水或耐涝性的潜在指标，这些潜在指标可用于进一步研究，作为大豆育种计划中选择、添加或基因聚合的标准。