应激性高血糖通过FOXK2 O-GlcNAc修饰损害巨噬细胞心肌梗死后心脏修复

《Cell Reports》：Stress hyperglycemia impairs FOXK2-dependent macrophage cardiac repair after myocardial infarction

　　

应激性高血糖（Stress hyperglycemia, SHG）预示心肌梗死（myocardial infarction, MI）后不良结局，但潜在机制仍不清楚。研究人员在此将FOXK2确定为巨噬细胞介导的心脏修复的关键调节因子。FOXK2表达在高血糖小鼠MI后的心脏巨噬细胞及伴有SHG的MI患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）中降低，而巨噬细胞特异性FOXK2缺陷加重了心脏损伤。在高糖条件下，FOXK2在T552位点被O-GlcNAc转移酶（O-GlcNAc transferase, OGT）糖基化，促进其泛素-蛋白酶体依赖性降解。质谱和功能分析显示，FOXK2T552A突变体抵抗高血糖诱导的降解。整合CUT&Tag和RNA-seq分析揭示，FOXK2通过抑制H3K27乙酰化限制促炎细胞因子表达。因此，研究人员的研究结果将FOXK2确定为高血糖期间支持心脏修复的关键调节因子，靶向过度的FOXK2 O-GlcNAc修饰可能为伴有SHG的MI患者提供治疗策略。

应激性高血糖（SHG）是心肌梗死（MI）后常见的急性血糖升高现象，与不良预后相关，至少10%的非糖尿病MI患者出现SHG，并伴随单核巨噬细胞炎症激活和氧化应激增强。然而，SHG通过炎症反应加重MI的分子机制尚未阐明。O-GlcNAc修饰（一种由O-GlcNAc转移酶[OGT]催化的蛋白质翻译后修饰）可作为细胞营养和应激传感器，其异常升高与高血糖和心血管疾病相关，但在MI合并SHG中的具体靶点仍不清楚。FOXK2是叉头框（FOX）转录因子家族成员，参与糖代谢、自噬与炎症调控，但其在心脏炎症中的作用及是否受O-GlcNAc修饰调节尚属未知。因此，该研究旨在揭示SHG加剧MI后心脏炎症和损伤的机制，并探索FOXK2在其中扮演的角色。

研究人员利用公开RNA-seq数据集（GEO: GSE176068）及转录因子富集分析（ChEA3）预测参与高糖反应的候选转录因子，并在急性高血糖MI小鼠模型中验证。随后，研究人员构建巨噬细胞特异性FOXK2敲除小鼠（Cx3cr1^creFoxk2^flox/flox），观察MI后心脏功能与重构变化。结合临床患者样本（68例非糖尿病急性MI患者，按应激性高血糖比率[SHR]分为低SHG组和高SHG组），研究人员发现FOXK2水平与SHG及MI严重程度负相关。机制上，通过质谱鉴定出FOXK2在T552位点发生O-GlcNAc修饰，并证明该修饰促进FOXK2经K11连接泛素化降解，解除其对促炎基因（包括IL-6/STAT3通路）的转录抑制。基于FOXK2-OGT结合模型，研究人员设计了细胞穿透肽Peptide-I，并在急性和慢性高血糖MI模型中验证了其心脏保护作用。该研究确立了FOXK2作为SHG导致心脏修复障碍的关键调节因子，为MI合并SHG的治疗提供了新策略。

关键的技术方法包括：患者队列（68例非糖尿病AMI，按SHR分组）；动物模型（葡萄糖注射诱导急性高血糖MI、db/db糖尿病MI、巨噬细胞特异性敲除小鼠）；RNA-seq和CUT&Tag及CUT&RUN-qPCR；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定O-GlcNAc位点；免疫沉淀（IP）、邻位连接技术（PLA）、生物层干涉（BLI）、分子对接；泛素化分析、Western blot、ELISA等。

研究结果如下：

1. 巨噬细胞FOXK2下调与MI期间的代谢变化和炎症反应相关：通过分析GSE176068数据集，高糖暴露的骨髓来源巨噬细胞（BMDM）中代谢相关基因上调。在急性高血糖MI小鼠心脏巨噬细胞中，FOXK2蛋白水平显著降低，而ZNF485和PA2G4无变化，FOXK2 mRNA亦无变化。患者PBMC中，高SHG组FOXK2蛋白水平较低；FOXK2水平与SHR、血糖、中性粒细胞/淋巴细胞比值（NLR）、心肌肌钙蛋白T（cTnT）及肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）负相关，与左室射血分数（LVEF）正相关。

2. 巨噬细胞FOXK2缺陷加重小鼠MI后心脏损伤：Cx3cr1^creFoxk2^flox/flox小鼠在MI后第3、7、28天心功能（EF、FS）明显降低，左室容积扩大，纤维化面积增加，心重/体重和肺重/体重比升高，死亡率增加，梗死边缘区CD31阳性血管减少，TUNEL阳性凋亡细胞增多，巨噬细胞浸润增加，促炎因子（Tnfα、Il1β、Il6等）mRNA表达升高。

3. 高糖暴露促进巨噬细胞FOXK2在T552位点的糖基化：高糖处理BMDM以剂量和时间依赖性降低FOXK2蛋白水平，但对mRNA无影响。高糖增强FOXK2的O-GlcNAc修饰，OGT抑制剂OSMI-1或OGT敲低可逆转。质谱鉴定T552为主要O-GlcNAc位点，FOXK2^T552A突变体抵抗高糖诱导的降解。体内给予OSMI-1可恢复FOXK2水平并改善MI合并SHG小鼠的心功能和重构。

4. OGT与FOXK2的相互作用促进FOXK2的O-GlcNAc修饰：FOXK2与OGT在细胞内和体外直接结合，高糖增强该相互作用。截短分析显示FOXK2的aa1-347区域和OGT的aa1-473区域介导结合，分子对接预测FOXK2的198-208残基参与。基于此合成的Peptide-I能够抑制FOXK2-OGT结合，剂量依赖性地逆转高糖诱导的FOXK2降解，并减少促炎因子表达。

5. O-GlcNAc修饰通过与OTUD4相互作用促进FOXK2的泛素-蛋白酶体降解：高糖加速FOXK2降解，蛋白酶体抑制剂MG132可阻断，而自噬抑制剂氯喹无效。高糖促进FOXK2的K11连接多聚泛素化。质谱筛选发现去泛素化酶OTUD4与FOXK2结合，高糖减弱该结合，OTUD4敲低降低FOXK2水平。FOXK2^T552A突变增强OTUD4结合并减少K11泛素化，说明T552位点O-GlcNAc修饰通过干扰OTUD4结合导致FOXK2降解。

6. 巨噬细胞FOXK2通过IL-6/STAT3信号通路抑制炎症反应：对MI后心脏巨噬细胞进行RNA-seq和CUT&Tag，发现FOXK2缺陷导致大量炎症通路基因上调和H3K27乙酰化增加，其中IL-6信号通路富集最显著。FOXK2缺陷增强了Il6、Il6ra、Il6st和Stat3基因启动子区域的H3K27ac修饰，并提高IL-6蛋白表达和STAT3的Y705磷酸化水平。患者血浆中IL-6水平在高SHG组也升高。

7. 来源于FOXK2的Peptide-I改善MI合并SHG后心脏损伤：在急性高血糖MI小鼠中，Peptide-I治疗降低LVEDV、LVESV，提高EF、FS，减小梗死面积，降低心重/体重比、肺重/体重比和死亡率，增加CD31阳性区域，减少TUNEL阳性细胞和CD68阳性巨噬细胞，恢复心肌巨噬细胞FOXK2蛋白，抑制IL-6/STAT3通路和促炎因子表达。在db/db慢性糖尿病MI模型中也获得类似保护效果。

讨论部分指出，FOXK2是SHG导致MI后心脏修复障碍的关键调控因子，其缺失导致全基因组H3K27乙酰化增加，激活多种细胞因子信号通路。O-GlcNAc修饰具有双重作用，而过度O-GlcNAc修饰促进FOXK2降解，OTUD4的参与揭示了其上游调控机制。Peptide-I作为概念验证性治疗，在急性和慢性高血糖模型中均有效，具有转化潜力。

研究结论：该研究定义了一个新的代谢-转录回路，应激性高血糖通过OGT介导的FOXK2在巨噬细胞中的O-GlcNAc修饰和降解，破坏心脏修复。恢复或维持FOXK2表达，或靶向FOXK2的O-GlcNAc修饰，可能为限制非糖尿病MI合并SHG患者的心脏炎症和疾病进展提供新型分子治疗策略。