《Toxics》：Salivary Lactoferrin and sIgA Levels in Relation to Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Exposure Among Children from an E-Waste Recycling Area
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本研究在贵屿与濠江两地纳入202名儿童开展横断面研究，测定尿液中多环芳烃（PAH）代谢物、唾液乳铁蛋白与分泌型免疫球蛋白A（sIgA）以及循环白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-17A（IL-17A）水平，采用多因素回归与贝叶斯核机器回归（BKMR）评估关
本研究在贵屿与濠江两地纳入202名儿童开展横断面研究，测定尿液中多环芳烃（PAH）代谢物、唾液乳铁蛋白与分泌型免疫球蛋白A（sIgA）以及循环白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-17A（IL-17A）水平，采用多因素回归与贝叶斯核机器回归（BKMR）评估关联，并结合网络毒理学整合比较毒理基因组学数据库（CTD）与GeneCards中PAH相关与龋齿相关靶点以探索免疫相关通路。暴露组尿液PAH代谢物及炎症细胞因子水平较高，唾液乳铁蛋白与sIgA水平较低。校正后，1-OHNap与两种唾液标志物均呈名义负相关，2-OHNap与9-OHPhe与sIgA呈名义负相关，经错误发现率（FDR）校正后均未保持统计学显著性。BKMR提示PAH混合暴露与sIgA存在总体负相关，在高暴露分位数下可信区间低于零，而乳铁蛋白的证据较不确证。网络毒理学突出显示与细菌防御、免疫球蛋白产生及免疫调节相关的候选通路。上述结果提示较高PAH暴露与唾液免疫标志物浓度改变相关，值得开展纵向与机制性研究。
研究背景方面，随着电子产品更新换代加快，电子垃圾已成为全球增长最快的固体废物之一。非正规拆解、露天焚烧与回收活动可向环境释放持久性有机污染物与重金属等复杂混合物，这些污染物可经空气、水、土壤和食物链进入人体。儿童处于生长发育快速阶段，代谢与免疫调节系统尚未成熟，对环境暴露可能更为易感，但有关电子垃圾相关污染物如何影响儿童免疫稳态、尤其是局部黏膜免疫防御的证据仍然有限。多环芳烃（PAH）是普遍存在的燃烧相关有机污染物，除电子垃圾拆解与焚烧排放外，交通排放、烟草烟雾、生活燃烧等也是重要来源。既往研究将PAH暴露与氧化损伤、免疫细胞功能改变及慢性低度炎症相联系，其中IL-6是参与辅助性T细胞17（Th17）分化的关键促炎细胞因子，IL-17A是Th17相关的主要细胞因子，在黏膜屏障免疫防御与稳态中发挥重要作用。然而多数研究聚焦全身性炎症、代谢紊乱与器官毒性，PAH对口腔黏膜免疫屏障的潜在影响及机制仍不清楚。口腔黏膜是持续暴露于外环境的important免疫界面，唾液在维持口腔微生物稳态中居中心地位，含多种抗菌与免疫调节分子，其中乳铁蛋白主要参与固有免疫，sIgA是黏膜表面适应性体液免疫的主要效应分子，二者共同构成唾液抗菌屏障的重要组成部分。已有证据提示环境污染物暴露可经氧化应激与炎症反应影响黏膜免疫功能，且PAH可透过颊黏膜与舌下黏膜并在黏膜组织内蓄积。既往在电子垃圾回收区儿童中的研究报告了铅暴露与唾液凝集素、唾液酸等防御相关因子浓度降低的关联，但PAH暴露尤其是混合暴露是否与乳铁蛋白和sIgA等关键唾液免疫因子改变相关、炎症过程是否参与其中，尚不明确。贵屿是中国主要电子垃圾回收区之一，既往研究报告该地儿童PAH水平升高且龋齿患病率高于参照区。在此背景下，研究人员系统评估尿PAH代谢物与唾液乳铁蛋白和sIgA的关联，并进一步应用BKMR评估混合PAH暴露与上述唾液黏膜免疫标志物的关联；鉴于既往报道的龋齿患病率差异，研究还将龋齿作为口腔结局纳入探索性网络毒理学分析，整合PAH相关与龋齿相关靶点以识别可能相关的生物学通路并探索口腔黏膜免疫过程的可能参与。
研究人员开展了一项横断面研究，于2017年11月至12月在汕头贵屿与濠江招募3–7岁幼儿园儿童共202名（暴露组与参照组各101名），所有参与者居住于研究地区均超过一年，且近期无严重感染、炎症或其他已知疾病；通过结构化问卷收集人口学特征、居住环境、儿童活动与饮食习惯、病史及家庭月收入等信息，并获得法定监护人书面知情同意。研究比较两组尿PAH代谢物、唾液乳铁蛋白与sIgA及循环IL-6、IL-17A水平，采用多因素线性回归评估单一代谢物与唾液标志物的关联，采用BKMR评估混合暴露的联合关联，并开展网络毒理学分析。结论显示，暴露组尿PAH代谢物与炎症细胞因子水平较高、唾液乳铁蛋白与sIgA水平较低；校正后1-OHNap与两种唾液标志物均呈名义负相关，2-OHNap与9-OHPhe与sIgA呈名义负相关，但经FDR校正后均未保持统计学显著性；BKMR显示PAH混合物与sIgA存在总体负相关（较高暴露分位数下可信区间低于零），而乳铁蛋白证据较不确证；网络毒理学提示与细菌防御、免疫球蛋白产生及免疫调节相关的候选通路。研究意义在于将环境暴露、全身炎症状态、唾液黏膜免疫改变与探索性通路证据整合于一致的生物学框架内，提示较高PAH暴露与唾液免疫标志物浓度改变相关，值得开展纵向与机制性研究。
在关键技术方法方面，研究人员采用气相色谱–质谱联用（GC–MS）测定尿液中10种羟基化PAH代谢物（OH-PAHs），并以尿肌酐水平进行标准化；采用ProcartaPlex多重免疫分析试剂盒结合Luminex 200分析仪测定血清IL-6与IL-17A；分别采用人乳铁蛋白酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒与唾液分泌型IgA间接酶免疫分析试剂盒测定唾液乳铁蛋白与sIgA；统计分析使用R 4.4.2、GraphPad Prism 10.1.1与SPSS 27.0，采用多因素线性回归与BKMR（5000次MCMC迭代、组件式变量选择与高斯核估计）评估关联，并采用Benjamini–Hochberg法进行FDR校正；网络毒理学方面，从CTD与GeneCards检索PAH与龋齿相关靶点（物种限定为Homo sapiens），经基因符号标准化与去重后取交集，基于STRING数据库构建蛋白–蛋白相互作用（PPI）网络，在Cytoscape 3.8.2中以Centiscape 2.2插件进行拓扑分析识别候选枢纽基因，并使用R软件的clusterProfiler包开展基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。样本队列来源为贵屿暴露组与濠江参照组各101名儿童。
研究结果方面，第一，人口学、社会经济、口腔健康与电子垃圾暴露特征：共纳入202名儿童，两组年龄与性别分布无显著差异，暴露组BMI较低且早期儿童龋（ECC）患病率较高（64.4% vs. 45.5%）；家庭吸烟分布存在显著差异，暴露组家庭每日吸烟10支及以上比例较高；参照组家庭月收入高于6000元者比例较高；暴露组儿童直接接触电子垃圾及居住于电子垃圾污染源50 m以内的比例均显著高于参照组。第二，尿PAH代谢物比较与相关性：暴露组经肌酐校正的尿PAH代谢物浓度总体较高，1-OHNap、2-OHNap与2-OHFlu显著升高，1-OHPhe、2-OHPhe、3-OHPhe、4-OHPhe、9-OHPhe与1-OHPyr亦升高，而9-OHFlu两组间无显著差异；Spearman相关分析显示各代谢物间呈正相关（r为0.41–0.73），同一PAH类别内相关性 generally更强，提示不同PAH可能共享暴露来源或存在共暴露模式。第三，唾液黏膜免疫标志物与循环炎症细胞因子比较：暴露组唾液乳铁蛋白与sIgA水平显著低于参照组，而循环IL-6与IL-17A水平显著高于参照组。第四，尿PAH代谢物与免疫炎症标志物的Spearman相关：尿PAH代谢物与循环IL-6、IL-17A总体呈弱正相关；与唾液乳铁蛋白和sIgA总体呈弱负相关，其中1-OHNap与乳铁蛋白负相关，1-OHNap、2-OHNap与9-OHPhe与sIgA负相关；IL-6与IL-17A呈强正相关，乳铁蛋白与sIgA呈中度正相关，IL-6与IL-17A均与乳铁蛋白呈弱负相关，而与sIgA无显著相关。第五，单一PAH代谢物与唾液乳铁蛋白和sIgA的关联：在粗模型及Model 1中，Ln1-OHNap与Ln2-OHNap与乳铁蛋白呈名义负相关；Model 2进一步校正后，Ln1-OHNap与乳铁蛋白保持名义负相关，Ln2-OHNap关联减弱，其余代谢物无名义显著关联；对sIgA，粗模型中Ln1-OHNap、Ln2-OHNap、Ln2-OHFlu与Ln9-OHPhe呈名义负相关，Model 2中Ln1-OHNap、Ln2-OHNap与Ln9-OHPhe呈名义负相关；敏感性分析进一步校正ECC后关联方向基本相似，但FDR校正后所有关联均未保持统计学显著，提示名义关联应谨慎解读。第六，BKMR分析：MCMC迹图显示模型收敛良好；总体混合效应分析显示随联合PAH暴露水平升高，乳铁蛋白与sIgA的估计效应均呈下降趋势，其中sIgA在高暴露分位数下可信区间持续低于零，提示显著的总体负相关，而乳铁蛋白的95%可信区间在若干暴露水平包含零；后验纳入概率（PIP）分析显示乳铁蛋白模型中Ln1-OHNap的PIP最高、Ln2-OHNap次之，sIgA模型中各代谢物PIP普遍较低且分布较均匀、无单一代谢物明显占优；条件效应与单污染物暴露–反应函数显示乳铁蛋白随1-OHNap浓度升高持续下降，2-OHNap与2-OHPhe亦呈负趋势，sIgA则随1-OHNap、2-OHNap、2-OHFlu、4-OHPhe与9-OHPhe浓度升高总体下降，而9-OHFlu、2-OHPhe、3-OHPhe与1-OHPyr呈正趋势。第七，尿PAH代谢物间潜在交互作用：BKMR双变量暴露–反应曲面总体变化平滑，条件暴露–反应曲线在第二代谢物固定于不同分位数时大致平行，未观察到强效应修饰或明显交互作用的证据。第八，网络毒理学分析：共识别451个PAH与龋齿重叠基因；PPI网络显示广泛相互作用；拓扑分析中XPA、RAD23B等基因在多项中心性指标中排名靠前；GO富集在生物学过程类别中包含对细菌的反应、对细菌的防御反应、抗菌体液反应、免疫球蛋白产生、免疫球蛋白介导的免疫反应、B细胞介导免疫、体液免疫反应与体液免疫调节等免疫与抗菌相关条目，细胞组分类别富集于细胞外区域、分泌颗粒、质膜、细胞外空间与细胞间黏附连接，分子功能类别主要富集于抗原结合、细胞因子活性、受体–配体活性与蛋白结合等；KEGG富集显示重叠基因参与PI3K–Akt信号通路、脂质与动脉粥样硬化、人巨细胞病毒感染、糖尿病并发症中的AGE–RAGE信号通路，以及HIF-1信号通路、IL-17信号通路、Toll样受体信号通路与炎症性肠病等免疫炎症相关通路。
讨论部分总结：本研究整合流行病学分析与探索性网络毒理学，发现暴露组儿童尿PAH代谢物与循环炎症细胞因子水平较高、唾液乳铁蛋白与sIgA较低；多因素回归识别出尿PAH代谢物与唾液标志物的名义负相关，但FDR校正后均未保持显著；BKMR显示乳铁蛋白随联合暴露呈下降但无统计学意义的趋势，而sIgA存在显著的总体混合负相关；探索性网络毒理学识别出与细菌防御、抗菌体液免疫、免疫球蛋白产生及B细胞介导免疫相关的候选生物学过程。研究人员指出，PAH是电子垃圾拆解与燃烧以及交通排放和生活燃烧产生的常见有机污染物，既往电子垃圾区人群研究一致报道儿童PAH暴露升高，与本研究的暴露模式一致；代谢物间较强相关性提示儿童通常同时暴露于多种PAH，混合分析可能比单一污染物模型更能反映真实环境暴露。关于PAH暴露与炎症反应的关联，既有实验与流行病学研究提示PAH可经芳香烃受体相关信号、活性氧生成与氧化还原失衡影响炎症过程，并调节NF-κB、MAPK等炎症相关信号网络，持续性氧化应激可促进促炎细胞因子产生并改变上皮与免疫细胞功能状态；本研究中尿PAH水平与循环IL-6、IL-17A总体正相关，提示暴露组儿童可能伴随低度炎症状态。这一炎症背景为理解唾液免疫防御改变提供了重要背景：唾液并非单纯分泌液，而是由腺泡细胞、导管上皮、局部免疫细胞与血液来源成分共同构成的复杂防御系统，唾液腺上皮细胞对氧化应激与持续炎症敏感，细胞内氧化还原稳态破坏可能损害腺泡分泌、蛋白合成与跨上皮转运，长期暴露于污染物相关炎症状态还可能改变唾液腺局部微环境进而影响分泌功能与免疫相关蛋白释放；本研究中IL-6与IL-17A与唾液乳铁蛋白呈弱负相关，提示乳铁蛋白降低可能与唾液腺炎症及氧化应激相关的分泌状态关系更密切，而二者与sIgA无显著相关，sIgA依赖局部产IgA浆细胞及经唾液腺上皮的跨上皮转运，代表黏膜体液免疫的独立组分，其唾液水平可能不与循环炎症细胞因子平行变化。乳铁蛋白是唾液固有免疫防御的重要组分，除通过高亲和力铁结合限制细菌生长外，还可直接与细菌表面相互作用、干扰细菌黏附并抑制生物膜形成，这些功能在口腔中与限制致龋微生物持续定植尤为相关；本研究中唾液乳铁蛋白随PAH暴露升高呈下降趋势，需要强调的是乳铁蛋白浓度降低并不必然意味着其抗菌功能质的丧失，而可能反映该固有免疫因子在口腔黏膜防御系统中可利用性的下降。sIgA与乳铁蛋白互补，是口腔黏膜表面适应性体液免疫的主要效应分子，通过免疫排斥、凝集与抑制细菌黏附等机制限制微生物在黏膜与牙面定植，其产生涉及B细胞分化为浆细胞、IgA合成及多聚免疫球蛋白受体介导的跨上皮转运，调控过程较单纯腺体来源蛋白分泌更为复杂；本研究中多种PAH代谢物与唾液sIgA呈名义负相关，而BKMR模型中各PAH组分的PIP相对较低且分布较广，提示sIgA降低可能与混合PAH暴露相关而非主要归因于单一代谢物。乳铁蛋白与sIgA的同时降低可能比单一标志物改变更具生物学意义，二者分别代表唾液固有与适应性抗菌防御的关键组分并协同维持口腔微生物稳态，其浓度降低在理论上可能削弱唾液抑制细菌生长、抑制生物膜、免疫排斥与细菌凝集的能力，为二者同时降低与致龋定植易感性之间提供了可能的生物学联系。本研究中唾液乳铁蛋白与sIgA呈明显正相关，提示二者可能作为口腔黏膜免疫组分协同变化；暴露组儿童ECC患病率亦较高，但本研究未直接检验唾液乳铁蛋白或sIgA与ECC患病率的关系，因此二者在组间的同时差异不应被解释为彼此存在直接关系的证据；鉴于ECC本身可能影响唾液免疫标志物，研究人员在敏感性分析中额外校正ECC后关联主要方向基本相似，但仍不能排除其他口腔健康与行为因素的残余混杂。研究人员还指出，既往关于口腔疾病中乳铁蛋白的研究结果并不完全一致，牙周炎研究报道唾液或龈沟液中乳铁蛋白升高，与本研究的降低相反，这一差异可能反映疾病背景与乳铁蛋白细胞来源的不同：活动性牙周炎以局部中性粒细胞大量浸润为特征，而乳铁蛋白是中粒细胞颗粒的丰富组分，炎症渗出与中性粒细胞脱颗粒可能显著提高局部乳铁蛋白浓度，此时乳铁蛋白升高可能主要反映炎症细胞募集而非黏膜防御增强；相比之下，本研究聚焦环境污染物暴露儿童而非活动性牙周组织破坏个体，观察到的乳铁蛋白降低可能更与唾液分泌及黏膜防御功能改变相关，也凸显乳铁蛋白的情境依赖性，其浓度可在不同病理或暴露条件下变化，生物学意义应结合潜在临床与暴露背景解读。本研究中IL-6与IL-17A同时升高而乳铁蛋白降低，为全身炎症与局部黏膜免疫的关系提供了进一步线索：IL-6与IL-17A参与广泛炎症反应，IL-17还参与维持黏膜屏障完整性与调节抗菌防御，在持续环境刺激条件下，炎症通路的过度或失调激活可能反映免疫稳态破坏而非更有效的黏膜保护，尤其在乳铁蛋白与sIgA等黏膜免疫因子降低的背景下，整体模式可能更符合以炎症激活增强伴口腔黏膜免疫状态改变为特征的免疫失衡。网络毒理学为观察到的唾液免疫改变提供了补充性生物学背景：PAH与龋齿共享基因不仅富集于广泛炎症通路，还富集于细菌防御与体液免疫相关生物学过程，鉴于乳铁蛋白在抗菌体液防御与sIgA在免疫球蛋白介导黏膜免疫中的既定作用，这些发现突出了可能与PAH相关唾液黏膜免疫标志物改变有关的候选生物学网络；KEGG富集进一步识别出涉及IL-17、Toll样受体、PI3K–Akt与HIF-1信号的通路，这些通路广泛参与微生物识别、黏膜免疫调节、细胞应激反应、炎症与免疫代谢，为研究中观察到的循环炎症细胞因子升高与唾液免疫标志物降低并存的現象提供了探索性生物学背景。综合而言，这些发现支持一个可能的生物学框架，即较高PAH暴露与全身炎症激活及局部口腔黏膜免疫环境改变均相关，唾液黏膜免疫因子（包括乳铁蛋白与sIgA）的变化可能反映口腔黏膜免疫稳态的改变，网络毒理学中抗菌体液免疫、免疫球蛋白产生与细菌防御相关通路的富集为这些观察提供了补充性生物学背景并突出了可能与唾液免疫改变相关的通路；因此本研究的意义不仅在于识别PAH暴露与唾液免疫标志物的关联，还在于将环境暴露、全身炎症状态、唾液黏膜免疫改变与探索性通路证据整合于一致的生物学框架内。研究局限包括：横断面设计无法确立PAH暴露、炎症与唾液免疫改变之间的时间关系，限制因果推断；单次尿PAH测量主要反映近期暴露，可能不代表长期暴露，尽管进行了多因素校正，仍不能排除未测量的环境、行为、饮食与口腔健康因素的残余混杂，且FDR校正后单一PAH关联均未保持统计学显著；未评估唾液pH、流率、腺体功能、氧化应激与IgA转运，限制了对潜在机制的解读，也未检测口腔微生物组与功能性免疫反应，使乳铁蛋白与sIgA降低的生物学意义仍不确定；此外，广泛的靶点选择可能限制富集结果的特异性，这些结果仍属假设生成性质，并未证明儿童体内通路激活。
研究结论部分翻译如下：总体而言，研究人员的发现提示较高PAH暴露可能与儿童唾液黏膜免疫标志物及全身炎症状态的改变相关。观察到的唾液乳铁蛋白与sIgA降低可能反映口腔黏膜固有与适应性免疫标志物的变化，尽管单一PAH关联经FDR校正后未保持统计学显著。探索性网络毒理学进一步突出了与细菌防御、抗菌体液免疫及免疫球蛋白相关过程有关的通路，提供了补充性生物学背景。这些发现值得通过纳入唾液腺功能、口腔微生物组与抗菌活性直接测量的纵向与机制性研究进一步探讨。
