睡眠依赖性基底外侧杏仁核恐惧印迹神经元中DNA甲基化重塑的研究

《Cell Reports》：Sleep-dependent DNA methylation remodeling in basolateral amygdala fear engrams

睡眠如何在单个印迹神经元内于分子水平上巩固恐惧记忆尚不清楚。研究人员利用活性依赖性标记和测序技术，对经历情境恐惧条件反射及学习后睡眠剥夺的小鼠基底外侧杏仁核（BLA）中的印迹与非印迹细胞核进行了DNA甲基化组和转录组图谱分析。恐惧学习诱导了印迹神经元中协调的CpG和CpH DNA甲基化重塑，每种类型均展现出独特的时序动态，揭示了CpH甲基化作为印迹表观遗传学特征的一个独立组成部分。值得注意的是，睡眠剥夺部分逆转了学习诱导的甲基化变化并损害了记忆回忆，表明睡眠支持印迹特异性的表观遗传巩固。通过整合印迹甲基化组与单细胞转录组图谱，研究人员构建了BLA恐惧印迹的多组学分子图谱，并鉴定出Mid1是一个受学习和睡眠调控的甲基化靶点。BLA整体及印迹特异性的Mid1敲低实验确立了其在恐惧记忆巩固中的功能必要性，为识别行为相关的表观遗传靶点提供了新方法。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

长期记忆的形成始于获取，随后经历巩固和储存阶段，以便在需要时进行提取。在巩固过程中，睡眠起着至关重要的作用。然而，睡眠如何在单个记忆编码神经元（即印迹细胞）层面实现记忆巩固的细胞和分子机制仍不清楚。

从细胞层面看，记忆被认为编码在特定的神经元集群——即印迹中，这些细胞在学习时被激活，发生生物物理和生化改变，成为记忆提取所必需的细胞。在经典的条件性恐惧范式下，海马、皮层、杏仁核等区域均已证实存在印迹。其中，基底外侧杏仁核复合体（BLA）是恐惧记忆的关键底物，也是创伤后应激障碍（PTSD）和焦虑症的主要失调位点。尽管已有研究表明压力可直接破坏外侧杏仁核的印迹集群导致恐惧泛化，但BLA印迹是否以及如何参与睡眠依赖的记忆巩固，及其背后的分子机制仍是未知数。

在分子层面，包括DNA甲基化在内的表观遗传修饰已被证实参与记忆处理。DNA甲基化因其生化稳定性以及以持久而灵活的方式编码经验依赖变化的理论能力，被认为是印迹的理想候选底物。该动态调控由DNA甲基转移酶（DNMTs）和TET去甲基化酶介导。然而，此前关于记忆的DNA甲基化研究缺乏印迹层面的分辨率，唯一一项印迹特异性研究仅关注CpG甲基化。因此，神经元特异性的非CpG（CpH）甲基化是否在印迹群体中被动态调控并贡献于BLA印迹功能，仍是一个悬而未决的问题。

二、研究概述与核心发现

本研究利用活性依赖性标记结合全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）和单细胞核转录组测序（PIP-seq），首次绘制了BLA恐惧记忆印迹细胞的基因组范围DNA甲基化和转录图谱。研究发现，恐惧学习诱导了印迹神经元中CpG和CpH甲基化的协同且动态的重塑，两者展现出不同的时间动力学。学习后的睡眠剥夺会减少BLA印迹细胞的招募，干扰学习诱导的甲基化变化，从而损害恐惧记忆。通过整合印迹甲基化组与单细胞转录组，研究人员鉴定出Mid1是一个受学习和睡眠调控的甲基化靶点，并通过BLA整体和印迹特异性敲低实验证实了其在恐惧记忆巩固中的功能必要性。这一发现揭示了睡眠依赖性甲基化重塑作为BLA依赖的恐惧记忆巩固的一个候选机制。

三、关键技术方法

研究人员使用了多种转基因小鼠品系，包括TRAP2（Fos^2A-iCreERT2）、CAG-Sun1/sfGFP和Dnmt3a^flox/flox，用于活性依赖性标记和基因敲除。核心技术包括：1）荧光激活细胞核分选（FANS）分离GFP阳性和阴性细胞核；2）全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）用于单碱基分辨率的DNA甲基化分析；3）PIP-seq（Fluent BioSciences）用于单细胞核转录组分析；4）立体定位注射AAV病毒载体实现BLA区域或印迹特异性的基因敲低/敲除；5）行为学测试包括情境和听觉恐惧条件反射及开放场测试。所有动物实验均遵循NIH指南并经哥伦比亚大学动物护理和使用委员会批准。

四、研究结果

1. BLA中的Dnmt对恐惧记忆至关重要

研究人员首先通过将TRAP2小鼠与Dnmt3a条件敲除小鼠杂交，在学习时标记的神经元（推定印迹细胞）中删除Dnmt3a，发现敲除小鼠在1周时表现出情境和听觉恐惧记忆的中度但显著的损伤，情境记忆损伤持续至1个月。为进一步探究BLA中DNA甲基化酶的功能，研究人员通过shRNA同时敲低Dnmt3a和Dnmt1，观察到无论在学习前还是学习后短时间内给予敲低，均导致严重的学习和记忆提取缺陷，证实BLA中的Dnmt3a和Dnmt1是恐惧学习和记忆所必需的。

2. 学习诱导BLA印迹中动态且不同的CpG和CpH甲基化变化

利用TRAP2;Sun1-GFP小鼠，研究人员在学习后第7天和第28天分离了GFP阳性和阴性细胞核并进行WGBS分析。结果显示，学习在第7天主要诱导CpG高甲基化和CpH低甲基化，而在第28天则转变为CpG低甲基化和CpH高甲基化，表明恐惧学习在长达一个月的时间内诱导了CpG和CpH甲基化的动态且不同的变化。基因组分布分析显示，CG-DMRs富集于CpG岛和增强子，而CH-DMRs更多位于基因间区。基因本体论（GO）分析表明，CG-DMGs富集于细胞内信号转导和突触组织通路，而CH-DMGs则富集于神经发育和细胞间粘附通路，提示两种甲基化模式调控不同但互补的神经元可塑性方面。

3. 睡眠剥夺对记忆印迹和DNA甲基化的影响

对学习后小鼠进行24小时完全睡眠剥夺（SD），发现SD显著损害了第7天的情境恐惧记忆提取，并降低了BLA中印迹细胞的再激活率。甲基组分析显示，与正常睡眠组相比，SD组在第7天表现为CG和CH位点的广泛高甲基化，而在第28天转为低甲基化。重要的是，SD引起的差异甲基化区域（DMRs）与学习诱导的DMRs高度重叠，但方向相反，表明睡眠剥夺部分逆转了学习相关的甲基化变化。PCA分析证实这些甲基化事件是印迹细胞特异的，非印迹细胞（GFP-）的甲基化组在不同条件下保持稳定。

4. BLA推定印迹神经元的转录组分析

通过PIP-seq对BLA细胞进行单细胞转录组分析，共获得12,183个细胞核，覆盖所有主要细胞类型。GFP+细胞主要为神经元，可分为四个谷氨酸能和四个GABA能亚型。PCA分析显示GFP+和GFP-神经元群在转录上是截然不同的。差异表达基因（DEGs）分析发现，在FC-Sleep GFP+细胞中，突触组织和RNA剪接相关基因在多个簇中富集，其中C1簇基因在FC-Sleep GFP+细胞中选择性上调，而SD则干扰了这一上调。这表明睡眠支持记忆巩固是通过上调突触和树突调节程序实现的。

5. BLA中的甲基化靶点Mid1是恐惧学习和记忆所必需的

通过整合甲基组和转录组数据，研究人员发现Mid1基因具有最强的差异甲基化位点，并与BLA推定印迹中的动态基因表达变化相关。Mid1基因座包含8个CG-DMRs，均在FC-Sleep组中特异性低甲基化，而这种低甲基化被SD破坏。BLA整体的Mid1敲低损害了学习和记忆提取。通过使用loxP-shRNA构建体在TRAP2小鼠中选择性地在恐惧条件反射激活的细胞中敲低Mid1，发现印迹特异性敲低足以损害记忆提取，确立了Mid1在BLA印迹群体中对恐惧记忆的必要作用。

五、讨论与结论总结

本研究的讨论部分指出，BLA中的DNMTs对于恐惧记忆是必需的，并且学习后的睡眠是DNMT依赖性表观遗传巩固的生理门控。通过整合印迹特异性甲基组和单细胞转录组，构建了BLA恐惧印迹的多组学分子图谱，并鉴定出Mid1为候选基因。研究发现学习诱导的Mid1去甲基化与其表达下调相关，这与传统的高甲基化导致基因沉默的模式不同，in vitro实验也支持在这些DMRs处甲基化可能发挥激活而非抑制的作用。研究局限性包括：24小时完全睡眠剥夺是一种非特异性应激范式；恐惧回忆测试可能引入检索相关的转录反应；尚未建立Mid1位点特异性甲基化与学习/记忆之间的直接因果联系。

研究结论翻译：本研究利用活性依赖性标记结合全基因组亚硫酸氢盐测序和单细胞核转录组测序，表征了恐惧记忆印迹细胞的基因组范围DNA甲基化和转录景观，揭示了学习后一个月内CpG和CpH甲基化的独特重塑。研究人员进一步证明，学习后的睡眠剥夺减少了BLA印迹细胞招募并干扰了学习诱导的甲基化变化，从而损害恐惧记忆，将学习后睡眠与印迹特异性表观遗传重塑联系起来。通过整合印迹甲基组与单细胞核转录组，鉴定出Mid1是一个受学习和睡眠调控的甲基化靶点，并通过BLA整体和印迹特异性操作证明了其对恐惧记忆的必要性。