裸盖菇素生物合成相关氨基酸代谢途径：Gymnopilus dilepis染色体水平基因组组装与转录组分析

《Journal of Fungi》：High-Quality Genome Assembly and Transcriptomic Analysis Reveal Potential Pathways for Psilocybin Biosynthesis in Gymnopilus dilepis

裸盖菇素（psilocybin）已在治疗焦虑、抑郁等心理健康疾病方面显示出疗效。现有证据表明，G. dilepis具备合成裸盖菇素的能力。因此，对该物种开展深入研究有助于理解裸盖菇素的生物合成机制，并为其生物合成提供更全面的认识。研究人员组装了G. dilepis的染色体水平基因组。G. dilepis的染色体数目为13，基因组大小为54.2 Mb，共预测到15,211个基因和16,411,190个转座元件（transposable elements）。进化分析表明，G. dilepis之所以能够合成裸盖菇素，是因其与Psilocybe属蘑菇亲缘关系较近。此外，转录组分析揭示裸盖菇素的生物合成与多条氨基酸代谢途径相关，尤其是半胱氨酸和蛋氨酸代谢（cysteine and methionine metabolism）、精氨酸和脯氨酸代谢（arginine and proline metabolism）以及色氨酸代谢（tryptophan metabolism）。这些途径可能为裸盖菇素生物合成提供所需的前体物质。本研究提供了G. dilepis的高质量基因组组装，并揭示了氨基酸代谢与裸盖菇素生物合成之间的密切关系，为探究G. dilepis的遗传关系及调控裸盖菇素生物合成的基因提供了理论基础。

裸盖菇素（psilocybin）近年来被发现具有治疗重度抑郁、焦虑及其他精神障碍的潜力，2018年美国批准了用于治疗抑郁症的裸盖菇素药物的开发与临床试验。裸盖菇素是致幻蘑菇中的一种精神活性药物，误食可引起幻觉、哭笑失控甚至意识丧失，但近年也被视为治疗焦虑、抑郁、强迫症（obsessive–compulsive disorder，OCD）和成瘾的新型药物。已有研究基于组学技术探究裸盖菇素合成途径：Fricke等通过基因组分析比较了Psilocybe cubensis与Psilocybe cyanescens，鉴定出裸盖菇素合成途径中的四个关键酶——L-色氨酸脱羧酶（PsiD）、磷酸激酶（PsiK）、甲基转移酶（PsiM）和单加氧酶（PsiH），并发现以色氨酸为底物合成裸盖菇素需PsiD、PsiH、PsiK和PsiM四种酶，而以4-羟基色氨酸为底物则需PsiD、PsiK和PsiM三种酶；Reynolds等对产裸盖菇素的P. cyanescens、G. dilepis、Panaeolus cyanescens（Pa. cyanescens）与非产裸盖菇素近缘种进行比较基因组分析，发现PsiD、PsiH、PsiK、PsiM及MFS转运蛋白（PsiT）基因均存在于产裸盖菇素蘑菇中并紧密排列形成基因簇，但Awan等发现P. cubensis和P. cyanescens分别较G. dilepis和Pluteus salicinus多出一个激酶和PsiT，且Reynolds提出的PsiT并不属于裸盖菇素合成基因簇，此外在Inocybe corydalina中可检测到裸盖菇素和baeocystin却未发现同源基因簇；Blei等随后证明色氨酸合酶（TrpB）可催化丝氨酸与4-羟基吲哚反应生成4-羟基色氨酸，再经PsiD、PsiK和PsiM作用合成裸盖菇素，进一步完善了Fricke提出的合成途径。转录组方面，Torrens-Spence等对P. cubensis进行RNA-seq，预测到多个类色氨酸脱羧酶蛋白，其中芳香族L-氨基酸脱羧酶（AAAD）能完成色氨酸脱羧这一裸盖菇素生物合成的起始步骤，且该脱羧反应由钙离子催化，提示芳香族氨基酸脱羧酶在P. cubensis裸盖菇素生物合成途径中起关键作用。既往G. dilepis基因组数据完整BUSCOs（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs，用于评估基因组完整性的BUSCO评分）=73.34%、N50（累计长度达到组装总长50%时的长度）=0.03354 Mb，表明基因组准确性不足。为此，研究人员采用Pacific Biosciences（PacBio）Sequel II平台全基因组环形共识测序（Circular Consensus Sequencing，CCS）对G. dilepis进行测序与组装，并利用高通量/高分辨率染色体构象捕获（Hi-C）图谱将多数组装contig锚定到13条染色体上；对G. dilepis与部分真菌物种基因组进行比较基因组分析以阐明其合成裸盖菇素能力的进化过程；并通过比较G. dilepis不同阶段的基因表达分析，发现参与裸盖菇素合成的基因和转录因子。研究结果为后续G. dilepis研究奠定基础，并为裸盖菇素的研究与利用提供理论框架。研究人员开展的关键技术方法包括：采用PacBio Sequel II平台CCS测序与Hi-C辅助组装，经Canu、HiCanu和HiFiasm组装并用BUSCO评估完整性，以3D-DNA锚定染色体、Juicebox校正；用RepeatModeler、RECON、RepeatScout、RepeatMasker及串联重复序列查找软件（TRF）预测重复序列；用GETA流程结合TransDecoder、GeneWise和AUGUSTUS进行基因注释；用MCScanx进行共线性分析并以Ks估算物种分歧时间；用超高效液相色谱（UPLC）结合光电二极管阵列（PDA）检测器测定裸盖菇素含量；用Illumina Novaseq 6000平台进行转录组测序并以StringTie计算FPKM，用KEGG自动注释服务器（KAAS）、Blast2GO和EggNOG-Mapper注释，用加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选模块，并以qRT-PCR验证。样本方面，G. dilepis双核体菌株来源于中国福建省食用菌种质资源中心，经原生质体裂解释放获得单孢菌株用于PacBio测序。
研究结果如下。3.1 组装与注释：据Kmer统计基因组大小约55.9 Mb，独特序列占75.5%，纯合序列（aa）占99.9%，杂合率（ab）为0.08%，组装相对简单；HiFiasm组装的contig数最少（178个），BUSCO评估中758个保守基因里获得730个完整同源基因（96.3%），含716个单拷贝基因（98.1%）和14个多拷贝基因（1.9%），为三种软件中最完整，故HiFiasm为最有效组装软件；经Hi-C数据3D DNA支架化并用JuiceBox可视化，各染色体较平滑、染色体内互作明显且随距离减弱，提示组装质量优良，染色体3上出现互斥（蓝色箭头），可能与染色体3上rDNA重复序列的鉴定有关，研究人员亦推测未切除的线粒体基因组可能参与此现象；染色体1、2、9、11、13上的红色箭头指示高活性区域；除染色体3和6外各染色体均鉴定到末端端粒且呈反向互补，提示高质量组装。最终基因组大小为54.2 Mb，获得178个contig，组装出13条染色体，contig N50为2.7 Mb，scaffold N50为4.4 Mb，最长contig为4.7 Mb；预测到15,211个基因模型，平均基因长度约2079.8 bp，平均外显子数6.4；鉴定到16,411,190个转座元件，基因分布较密集；基因组序列分析共发现251个tRNA基因，通过比较NCBI数据库中担子菌rRNA序列，在染色体3上发现2个5.8S rRNA基因、3个18S rRNA基因和5个28S rRNA基因；重复序列占全基因组7.60%，其中逆转录因子和长末端重复序列（LTR）在散在重复序列中最丰富，其次为LINE和Tad1，上述转座子占总基因组4.01%，非散在重复序列中的简单序列占0.66%，另有占基因组4.43%的重复序列未分类。3.2 共线性与进化分析：选取Pa. cyanescens、G. junonius、P. cubensis、C. cinerea、S. citrinum和N. crassa代表菌株进行共线性分析，担子菌与子囊菌间未发现共线性，可能与其进化历史有关；Gymnopilus属与Psilocybe属间共线性程度高于Coprinopsis与Scleroderma间，可能与物种分化越晚共线性越好有关；在G. dilepis的Chr2、Chr4、Chr5和Chr6上，G. dilepis与Pa. cyanescens间发生显著的染色体断裂与融合事件；在Gymnopilus属内，G. dilepis与G. junonius共线性程度高，但G. junonius基因组未组装至染色体水平，无法观察染色体间进化关系；P. cubensis与G. dilepis共线性强，13条染色体一一对应；共线性分析揭示染色体重排、基因组复制和基因突变在物种进化中具有规律性。以Ks估算物种进化时间，G. dilepis与G. junonius峰值拐点约1.6，G. dilepis、P. cubensis与C. cinerea约1.9，G. dilepis与Pa. cyanescens约2.75，表明G. dilepis与Pa. cyanescens分化早于与其他真菌物种的分化，同属Gymnopilus的G. junonius与G. dilepis分化最晚；S. citrinum与Pa. cyanescens、G. dilepis、G. junonius、P. cubensis和C. cinerea的峰值拐点约2，表明S. citrinum从伞菌目物种分化早于G. dilepis与G. junonius的分化。3.3 菌丝体与子实体RNA-Seq差异表达分析：UPLC测定显示菌丝体裸盖菇素含量为3.7 μg/g，子实体显著更高，达275 μg/g；对6个菌丝体和子实体样本进行RNA-seq，基于各转录本FPKM值的相关性分析显示组内关联强、组间差异有统计学意义，证明生物学重复可靠并揭示不同阶段基因表达显著差异；共获2131个差异表达基因（DEGs），其中1103个上调、1028个下调；GO富集分析中DEGs主要富集于生殖过程、多生物过程、信号传导、翻译调节活性、电子载体活性、转运蛋白活性、分子功能调节、细胞连接、共质体和超分子纤维等类别，其中生殖过程和超分子纤维相关类别在子实体阶段上调，可能与子实体生长相关；KEGG富集分析中，子实体上调DEGs富集于淀粉和蔗糖代谢、碳代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、半乳糖代谢及糖酵解/糖异生等代谢途径，可能反映从菌丝生长阶段向子实体阶段的转变，子实体主要利用淀粉、蔗糖和半乳糖等碳源；此外部分上调基因参与代谢途径、次生代谢物生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢及氨基酸生物合成，既往研究提示氨基酸相关生物合成途径可能参与裸盖菇素生物合成，但功能富集分析鉴定到大量基因，尚需进一步研究。3.4 WGCNA筛选DEGs：采用WGCNA分析转录组数据，先以基于基因表达水平的动态树切割法获得初始模块，再以基于模块特征值相似性的合并近邻模块法合并表达模式相似的模块，最终得到21个以不同颜色表示的模块；MEbrown模块基因在菌丝体阶段的表达水平低于子实体阶段，与裸盖菇素含量趋势一致，故推测MEbrown模块内基因可能对裸盖菇素生物合成起正向调控作用，并选取该模块内共表达基因进行功能富集分析；对棕色模块内2146个基因进行GO和KEGG功能富集分析，基因显著富集于蛋白酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性（GO:0008138）、异亮氨酸-tRNA合成酶活性（GO:0004822）、半胱氨酸合酶活性（GO:0004142）和丙酮酸脱氢酶（乙酰转移）激酶活性（GO:0004740）等GO功能类别，KEGG功能富集分析则显著富集于半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢及色氨酸代谢。3.5 qRT-PCR验证转录组：鉴于上述研究表明半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢及色氨酸代谢与裸盖菇素合成密切相关，选取编码胱硫醚γ-裂解酶的Gdcth基因和Gdtrp基因进行定量PCR分析，并对已报道参与裸盖菇素生物合成的关键酶PsiH、PsiD、PsiK和PsiM以及S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶（SAHH）进行qPCR分析以验证裸盖菇素生物合成候选基因；其表达水平以RNA-seq数据（FPKM值）量化，并通过qPCR进一步验证相对表达，效率在90%–110%的引物对被认为适合后续表达分析，qPCR反应的熔解曲线呈单峰；定量结果与FPKM值一致，值得注意的是除Gdtrp外，其余基因在子实体中的表达水平均高于菌丝体。
讨论部分总结：裸盖菇素近年被发现具有治疗重度抑郁、焦虑和其他精神障碍的潜力，2018年美国批准用于治疗抑郁症的裸盖菇素药物开发与临床试验；本研究聚焦能产裸盖菇素的G. dilepis，获得高质量基因组，为遗传研究提供理论基础。本研究采用PacBio Sequel II平台CCS并结合Hi-C将G. dilepis基因组定位到染色体水平，基因组大小54.2 Mb，含13条染色体，contig N50为2.71 Mb，重复序列占基因组7.6%，低于Hypsizygus marmoreus（11.6%）、Lentinula edodes（16.2%）和Cercospora sojina（25.6%）；共预测15,211个基因，提示基因密度较高。此前Reynolds等用二代测序技术组装并发表了G. dilepis基因组，未组装至染色体水平，含5668个scaffold，基因组大小46.7 Mb，scaffold N50为34 kb，完整BUSCO为73.43%；比较分析表明本研究组装的基因组在完整性和准确性上均更高。共线性分析表明G. dilepis、G. junonius与P. cubensis间共线性强，与Pa. cyanescens共线性较弱；C. cinerea与G. dilepis共进化中发生一次染色体融合，而Pa. cyanescens与G. dilepis共进化中发生三次染色体融合；G. dilepis与P. cubensis染色体呈一一同源关系，表明这两个物种成种相对较近且未发生染色体重排事件；共线性分析进一步证实担子菌目内G. dilepis、G. junonius与P. cubensis间系统发育关系密切，这一系统发育背景阐明了G. dilepis合成裸盖菇素的能力，该能力也为P. cubensis所具备。目前估计物种分歧时间的方法主要依赖分子钟假说，即基于特定类群化石记录假设相似物种具有可比进化速率，从而估算系统发育树上某节点的分歧时间并推断该类群起源时间；Silvestro等发现使用化石年代会导致时间估计的显著误差，而Ks不受自然选择影响，可用于判断物种历史上是否经历多倍化或成种事件；此外Gymnopilus类蘑菇的化石记录尚未发表，故本文采用Ks值计算G. dilepis、Pa. cyanescens、G. junonius、P. cubensis、C. cinerea和S. citrinum等物种的进化时间，为担子菌门进化历史研究提供关键证据；由公式T = Ks/2r推得G. dilepis与G. junonius分歧发生于108.4百万年前，G. dilepis、P. cubensis与C. cinerea的共同祖先分歧早至128.7百万年前，G. dilepis与Pa. cyanescens于135.5百万年前分歧，G. dilepis在3百万年前经历一次全基因组复制事件；本研究为深入研究大型真菌物种多样化及担子菌基因组进化模式提供数据支撑和理论基础，并从物种进化角度阐明G. dilepis产生裸盖菇素的机制，从基因组水平解释了G. dilepis为何能像Psilocybe一样产生裸盖菇素。迄今除色氨酸合成途径外，对裸盖菇素生物合成途径的研究有限；本研究通过UPLC-PDA分析G. dilepis菌丝体和子实体的裸盖菇素含量，发现子实体中裸盖菇素浓度约为菌丝体的七十四倍，与Demmler等报道的子实体裸盖菇素浓度高于菌丝体的结果一致；此外G. dilepis中裸盖菇素含量约为0.3%（w/w），与P. cubensis子实体中观察到的0.4%（w/w）水平相当。随后选取不同生长阶段的G. dilepis样本进行转录组分析，对DEGs进行GO富集分析，信号传导、翻译调节活性、转运蛋白活性、分子功能调节、细胞连接和共质体可能参与裸盖菇素生物合成；KEGG富集分析揭示上调基因富集于氨基酸及其衍生物代谢途径以及过氧化物酶途径，其中过氧化物酶主要参与代谢和活性氧信号分子代谢等重要过程，可能促进裸盖菇素生物合成；此外氨基酸已被证明可作为生物碱合成的前体并与裸盖菇素产生密切相关，该发现与WGCNA结果一致，为进一步研究其影响裸盖菇素生物合成的机制提供有价值切入点，以期奠定裸盖菇素体内或体外合成的基础。
研究结论部分翻译：本研究在染色体水平组装了G. dilepis的基因组，该物种染色体数目为13，基因组大小为54.2 Mb，含15,211个预测基因和16,411,190个转座元件；进化分析表明G. dilepis与Psilocybe属亲缘关系密切，为其生物合成裸盖菇素的能力提供了进化依据；此外，对G. dilepis不同发育阶段的转录组分析揭示，差异表达基因主要富集于半胱氨酸和蛋氨酸代谢途径、精氨酸和脯氨酸代谢途径以及色氨酸代谢途径。该高质量基因组可作为功能基因组学、进化分析和精准分子育种的基础资源，而转录组数据将裸盖菇素生物合成与多条氨基酸代谢途径联系起来并锁定关键生物合成基因，从而为该天然化合物的生产建立了机制性分子框架。