靶向CHOP/ATF4表达的小分子抑制剂用于神经保护药物开发

《Cell Reports》：Neuroprotectant development from small molecule inhibitors of CHOP/ATF4 expression

青光眼是一种亟需神经保护治疗的神经退行性疾病。研究人员此前揭示了视神经损伤诱导的神经元内质网（endoplasmic reticulum，ER）应激在青光眼性神经退行性病变中的关键作用，并证实调控ER应激的ATF4-CHOP分支可提供显著的神经保护。本文通过高通量筛选（high-throughput screening，HTS）鉴定出多个可抑制ER应激诱导的C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）表达的新型化学系列。研究人员对其中一个“命中”化合物CH-126进行了构效关系（structure-activity relationship，SAR）分析，并确立了其两个具有强效抑制CHOP和激活转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）表达活性的类似物。研究人员进一步在两个视神经病变模型中证实了它们的神经保护功效；在两个模型中，它们均提高了视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）胞体和轴突的存活率，并保留了视觉功能。综上，这一概念验证性证据确立了新型ER应激调节剂作为进一步药物开发的候选化合物，有望为青光眼和其他视神经病变，乃至多种中枢神经系统轴突病变提供神经保护治疗。

一、研究背景与科学问题

青光眼是全球导致不可逆性失明的最常见原因，预计到2040年将影响全球40岁以上人口的约3%（超过1亿人），给社会带来数十亿美元的经济负担。青光眼以视神经（optic nerve，ON）变性和随之进行的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）进行性死亡为特征。眼压（intraocular pressure，IOP）升高是最常见的危险因素，目前所有获批疗法均以降低IOP为目标。然而，即便接受治疗，仍有40%–50%的患者会进展为不可逆的视力丧失。因此，开发能够直接保护RGC及其轴突的神经保护药物具有重大的临床意义。

既往研究已证实，视神经损伤诱导的神经元内质网（endoplasmic reticulum，ER）应激在RGC死亡和轴突变性的病理生理过程中发挥关键作用。ER应激激活三条由ER驻留应激感应蛋白介导的信号通路：肌醇需求酶1α（inositol-requiring protein-1，IRE1α）、激活转录因子6（activating transcription factor-6，ATF6）和蛋白激酶RNA样ER激酶（protein kinase RNA-like ER kinase，PERK），合称未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）。慢性ER应激的一个关键特征是早期短暂但具有保护性的IRE1α-XBP-1激活，以及晚期持续但促凋亡的ATF4-CHOP激活。CHOP是公认的促凋亡转录因子，通过下调抗凋亡Bcl2、上调促凋亡BH3-only分子Bim和PUMA、增加死亡受体5（DR5）表达及caspase-8裂解来介导ER应激诱导的细胞死亡。ATF4还可与CHOP形成异二聚体，通过上调蛋白质合成和诱导氧化应激导致细胞死亡。

鉴于CHOP/ATF4通路在多种急慢性神经退行性疾病中的重要性，鉴定ATF4/CHOP小分子抑制剂是神经保护药物开发的重要策略。研究人员此前通过小规模筛选发现了FDA批准的药物马普替林（maprotiline）作为有效的ATF4/CHOP抑制剂，并在两个小鼠视神经病变模型中证实了其神经保护作用。在此基础上，本研究开展了大规模细胞水平高通量筛选，以期发现更有效的CHOP抑制剂。

二、研究内容与主要结论

研究人员利用CHOP启动子驱动的荧光素酶（CHOP-Luc）报告细胞系，对118,000个化合物进行了大规模高通量筛选（high-throughput screening，HTS），在衣霉素和毒胡萝卜素（Tm&Tg）诱导的ER应激条件下，鉴定出639个“初级命中”化合物，经去除具有细胞毒性或一般性荧光素酶抑制活性的化合物后，进一步通过剂量反应实验确定了312个潜在的新型CHOP抑制剂。研究人员从中选出IC₅₀最低的16个化合物进行验证，最终确定CH-126为领先化合物。

通过对CH-126进行构效关系（structure-activity relationship，SAR）分析，研究人员设计并合成了68个高纯度类似物。筛选发现，环A上的-COOMe基团和两个环结构之间的连接基对CHOP抑制活性至关重要。在环A中，-COOMe基团在噻唑硫原子的间位取代时活性增强，在对位取代时活性降低；在环B中，噻唑硫原子间位的吸电子取代基通常更有利。最终鉴定出T-22作为强效类似物，其抑制CHOP和ATF4 mRNA及蛋白水平的能力与CH-126相当。T-2029和T-27虽也有效，但溶解度过低无法用于动物实验。

在体内实验中，研究人员在创伤性视神经挤压（optic nerve crush，ONC）模型和硅油诱导高眼压（silicone oil-induced ocular hypertension，SOHU）青光眼模型中验证了CH-126和T-22的神经保护作用。在ONC模型中，玻璃体内注射CH-126或T-22可显著抑制3天时RGC中CHOP的表达，并在14天时显著提高RGC胞体和轴突的存活率。在SOHU青光眼模型中，两种化合物处理显著保留了神经节细胞复合体（ganglion cell complex，GCC）厚度，改善了图形视网膜电图（pattern electroretinogram，PERG）振幅和视动跟踪反应（optokinetic tracking response，OKR）测量的视敏度，并显著提高了RGC胞体和轴突的存活率。

三、主要技术方法

本研究采用的关键技术方法包括：基于CHOP-Luc报告细胞系的细胞水平高通量筛选（筛选约118,000个化合物，来源包括ChemDiv、ChemDiv Kinase、Specs和ChemBridge化学库）；构效关系分析（设计合成68个CH-126类似物）；定量实时PCR（qPCR）和蛋白质印迹（western blot）检测CHOP/ATF4表达；理化性质和ADME相关检测（包括血浆蛋白结合率、血浆稳定性、LogP、双向渗透性和动力学溶解度）；小鼠ONC创伤性视神经病变模型和小鼠SOHU青光眼模型；玻璃体内注射给药；光学相干断层扫描（OCT）活体视网膜成像；PERG和OKR视觉功能检测；视网膜铺片免疫荧光染色及RGC计数；视神经半薄切片及轴突定量分析。实验使用C57BL/6J小鼠（购自The Jackson Laboratory）。

四、研究结果

细胞水平HTS鉴定出多个抑制ER应激诱导CHOP表达的化学系列： 通过对118,000个化合物进行重复筛选，获得639个初级命中化合物，经剂量反应实验确认312个潜在新型CHOP抑制剂。对IC₅₀最低的16个化合物进行验证，最终确定CH-126为领先化合物，其对CHOP和ATF4 mRNA的抑制效果与已知ER应激抑制剂ISRIB相当。

SAR研究确定CH-126类似物T-22为强效CHOP/ATF4抑制剂： 通过设计合成68个类似物并进行第二轮筛选，鉴定出T-22、T-2029和T-27三个在蛋白水平显著抑制CHOP和ATF4的类似物。由于T-2029和T-27溶解度不足，选择T-22进行体内实验。CH-126和T-22不直接影响PERK或eIF2α的磷酸化，也不影响IRE1α、XBP-1剪接或ATF6水平，提示其作用机制更直接作用于CHOP/ATF4。

CH-126和T-22在创伤性ONC模型中抑制神经元ER应激并提供显著神经保护： 在ONC模型中，玻璃体内注射CH-126或T-22显著抑制了3天时ONC诱导的RGC中CHOP表达，并在14天时显著提高了RGC胞体和轴突的存活率，且未产生显著的轴突再生。

CH-126和T-22在SOHU青光眼模型中促进RGC胞体和轴突存活并保留视觉功能： 在SOHU青光眼模型中，两种化合物处理显著保留了GCC厚度，改善了PERG振幅和OKR视敏度，组织学分析确认了RGC胞体和轴突存活率的显著提高。

五、讨论与结论

本研究的关键问题之一是这些化合物抑制CHOP/ATF4的分子靶点。与马普替林通过拮抗组胺受体H1（HRH1）阻断ER Ca²⁺释放的机制不同，CH-126/T-22不影响CHOP/ATF4上游的经典ER应激信号分子，提示可能存在更直接作用于CHOP/ATF4的新机制。亲和力下拉结合质谱（mass spectrometry，MS）蛋白质组学分析有望揭示其具体分子靶点。

尽管ONC和青光眼模型在损伤性质、转录组变化和RGC亚型易感性方面存在显著差异，但神经元ER应激是两种疾病的共同特征，表明CHOP抑制对一般视神经病变的神经保护具有相关性。

研究结论：概念验证研究提供了强有力证据，表明一系列体外细胞实验结合SAR分析和体内动物模型应用可以发现新型有效的ER应激调节剂和强效神经保护剂。CH-126及其类似物的鉴定提供了潜在的神经保护候选药物，值得进一步的临床前和临床药理学开发，有望为满足重大未满足的临床需求提供创新有效的神经保护治疗。

研究局限性： 第一，HTS最好使用神经元细胞系进行，但这需要更多时间和资源来建立基于神经元的CHOP检测体系。第二，本研究聚焦于一个“命中”化合物及其类似物，其他“命中”化合物可能具有更适合神经保护开发的理化性质。CH-126和T-22的溶解度较低，理化性质存在缺陷，可能显著降低其生物学效应，因此难以直接与已优化溶解度、稳定性和药代动力学的马普替林进行体内疗效比较。第三，这些化合物抑制CHOP的分子作用机制尚不清楚，未来的亲和力下拉蛋白质组学研究可能提供靶点和机制方面的见解。