含多核苷酸的胶原膜促进去卵巢大鼠颅骨缺损骨再生的研究

《Bioengineering》：Polynucleotide-Incorporated Collagen Membrane Enhances Bone Regeneration in Calvarial Defects of Ovariectomized Rats

　　

引导骨再生（Guided Bone Regeneration, GBR）联合传统胶原膜在雌激素缺乏条件下可能仅产生有限的骨形成效果。本研究评估了负载高分子量多核苷酸（Polynucleotide, PN）的胶原膜能否促进骨质疏松大鼠的骨再生。将PN（约5 mg）负载至猪源胶原膜上，并通过衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）、X射线衍射（XRD）及体外释放实验对其进行表征。研究人员在30只去卵巢雌性Sprague–Dawley大鼠颅骨上制备双侧5 mm缺损，分别设为不填充（Control）、单纯覆盖胶原膜（Mem）或覆盖含PN胶原膜（PN_Mem）组（每组每时间点n = 10个缺损）。在术后4周和8周，通过微型计算机断层扫描（micro-CT）、Masson三色染色及针对runt相关转录因子2（Runx2）和骨形态发生蛋白-2/4（BMP-2/4）的免疫组织化学染色评估再生情况。PN以物理方式掺入并呈双相释放（8小时内约释放50%，7天内约释放77%）。4周时各组骨体积无显著差异；而8周时，PN_Mem组骨体积（5.98 ± 2.20 mm3）显著大于Control组（1.24 ± 0.67 mm3；p < 0.0001）和Mem组（2.52 ± 1.79 mm3；p < 0.001），且Runx2阳性细胞数量多于上述两组，BMP-2/4免疫反应强度亦强于Control组。PN的掺入增强了胶原膜在该骨质疏松颅骨缺损模型中的成骨性能；仍需在临床相关的牙槽骨缺损模型中进行验证。

论文解读

一、研究背景与目的

骨质疏松是一种以骨量减少、骨微结构退化和骨骼脆性增加为特征的系统性骨骼疾病，其根本原因在于骨吸收与骨形成之间的失衡。该病在绝经后女性中尤为高发，雌激素缺乏不仅增强破骨细胞的分化与活性，还损害成骨细胞介导的骨形成过程。此外，雌激素缺乏与衰老还伴随炎症信号改变、氧化应激增强、祖细胞功能受损及血管生成障碍，使得骨质疏松状态下的骨组织不仅骨量减少，其生物学环境也发生了改变，修复能力因此受损。

随着人口老龄化，骨质疏松与牙齿缺失的发生率同步上升，相当比例需要种植牙治疗的患者存在系统性骨量减少。拔牙后牙槽嵴发生进行性体积丧失，常需在种植前或种植同期进行水平或垂直向骨增量。虽然骨质疏松并非种植治疗的绝对禁忌证，但去卵巢动物实验已证实雌激素缺乏对自发性和生物材料辅助的骨再生均产生不利影响。因此，在骨质疏松条件下进行骨增量时，增强局部成骨能力尤为重要。

目前骨质疏松的药物治疗包括抗骨吸收药物（如双膦酸盐和地诺单抗）和促骨形成药物（如甲状旁腺激素类似物和硬骨素靶向抗体），但这些治疗能降低骨折风险、改善全身骨骼参数，却无法重建局部牙槽骨缺损，也不能在手术部位提供靶向再生刺激。此外，抗骨吸收药物在口腔手术中需特别谨慎，因为药物相关性颌骨坏死（MRONJ）风险虽在骨质疏松剂量下不常见，但牙槽外科手术后仍可能发生。因此，局部再生策略备受关注。

引导骨再生（GBR）是种植牙领域重建局部牙槽骨缺损最广泛使用的方法之一，其原理是在缺损上方维持隔离空间并排除快速增殖的非成骨性软组织细胞，使成骨细胞和血管能够重新定植于该区域。可吸收胶原膜因其生物相容性、操作性能、止血特性及无需二次手术取出等优点而被广泛使用。然而，传统胶原膜主要作为屏障设计，其相对快速的生物降解缩短了有效屏障功能的时间，机械稳定性有限，且缺乏强效骨诱导刺激，在宿主愈合能力降低时其有效性可能受限。

因此，越来越多的研究致力于将胶原膜从被动屏障转变为生物活性递送平台，通过掺入成骨分子、生长因子或其他再生制剂实现。例如，将骨形态发生蛋白-2（BMP-2）应用于胶原GBR膜可增强临界大小缺损的骨形成，局部递送BMP-2甚至在去卵巢诱导的骨质疏松大鼠中改善了牙槽骨再生。然而，强效重组生长因子在剂量控制、局部滞留、成本和不良反应方面存在顾虑，这促使研究者寻找通过更广泛影响细胞存活、细胞外基质形成、炎症和局部愈合环境来支持再生的替代生物活性物质。

多核苷酸（PN）是从DNA来源的聚合分子，近年来作为再生医学中的生物活性材料受到关注，尤其在皮肤和软组织再生领域，已报道其对细胞增殖和迁移、细胞外基质产生及炎症反应具有影响。虽然PN和聚脱氧核糖核苷酸（PDRN）并非完全相同的制剂，但研究较充分的PDRN已被认为通过核苷酸补救途径和腺苷受体信号传导促进组织修复，同时具有促血管生成和抗炎作用。由于血管生成、炎症调控、成骨细胞募集和基质形成在骨愈合过程中紧密整合，核苷酸衍生制剂在硬组织再生中也可能具有潜力。

现有临床前证据支持这一可能性。PDRN作为骨移植辅助材料已在牙槽嵴保存、种植体周围裂开缺损增量和上颌窦底提升中进行研究，多项研究报告早期骨形成增强或部分组织形态计量参数改善。但证据仍然有限，且各结局指标间效果并不一致；更重要的是，这些研究中PDRN均与骨替代材料联合应用，无法单独评估膜递送制剂的作用。核酸衍生材料也被直接用于骨研究：鲑鱼DNA被报道可促进大鼠颅骨缺损中的成骨细胞迁移和骨再生；PDRN在药物相关性颌骨坏死等受损条件下也得到评估。然而，现有骨相关证据主要涉及PDRN或DNA支架，而非高分子量PN，且很少涉及雌激素缺乏条件下的愈合。

本研究与以往工作有三点不同：其一，研究高分子量PN，这是不同于以往口腔骨研究中使用的PDRN的制剂；其二，使用市售胶原GBR膜作为唯一载体，不含骨替代材料，从而可分离膜递送PN的效应；其三，在雌激素缺乏动物中评估该策略，并进行了理化表征和负载膜的体外释放分析。研究假设含PN的胶原膜比不含PN的传统胶原膜能促进更多新骨形成。

二、主要技术方法

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：使用衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）和X射线衍射（XRD）对PN、未处理胶原膜及含PN胶原膜进行理化表征；通过紫外分光光度法（260 nm吸光度）结合PN-free膜背景扣除，评估PN从胶原膜的体外累积释放曲线；动物实验选用6周龄雌性Crl:CD(SD) SPF大鼠（Orient Bio Inc.，韩国城南），行双侧卵巢切除术后4周建立雌激素缺乏骨质疏松模型，制备双侧5 mm颅骨临界大小缺损，按平衡不完全区组设计分配至不填充对照组、单纯胶原膜组和含PN胶原膜组；通过微型计算机断层扫描（micro-CT）定量分析缺损区骨体积（BV）和骨矿物质密度（BMD）；通过Masson三色染色进行组织学评估；通过免疫组织化学染色检测Runx2阳性细胞数和BMP-2/4相对染色强度；采用线性混合效应模型进行统计分析，以动物个体为随机效应，Tukey法校正多重比较。

三、研究结果

3.1 ATR-FTIR分析

胶原膜（COL）光谱显示酰胺A（约3300 cm^?1）、酰胺B/CH₂伸缩（约2930 cm^?1）及酰胺I（约1630–1650 cm^?1）、酰胺II（约1540 cm^?1）和酰胺III（约1230–1240 cm^?1）特征带。PN光谱显示碱基相关吸收（1700–1500 cm^?1区域）及PO₂^?不对称伸缩（约1220–1240 cm^?1）和对称PO₂^?伸缩与脱氧核糖C–O伸缩（约1060–1080 cm^?1）特征带。COL + PN光谱保留了胶原酰胺特征并呈现PN相关磷酸盐/糖–磷酸骨架贡献，支持PN成功掺入胶原膜，但未发现新的独立吸收带，不能确定PN与胶原之间的分子间相互作用性质。

3.2 XRD分析

PN呈以2θ = 20–22°为中心的宽弥散晕，符合无定形结构。未处理胶原膜（Mem）在约2θ = 7–8°处显示低角度反射（对应约1.1–1.2 nm晶面间距，归属于胶原三螺旋的侧向分子间堆积），并在约2θ = 20°处呈宽弥散散射。含PN胶原膜（PN_Mem）在约2θ = 27.4°、31.7°、45.4°、56.5°、66.2°和75.3°处出现尖锐反射，与立方晶系氯化钠（岩盐）的(111)、(200)、(220)、(222)、(400)和(420)反射位置一致，可能源自生理盐水载体干燥过程中的结晶。由于未纳入经盐水处理但不含PN的膜作为对照，该来源未被独立证实。

3.3 PN累积释放曲线

PN从含PN胶原膜的释放呈双相模式：初始爆发相后接缓慢持续相。0.5小时内释放约7%，1小时内约16%，4小时内约32%，8小时时约50%；此后释放速率显著降低，24小时约60%，48小时约65%，72小时约70%，168小时约77%。约23%的PN在7天孵育期内未在释放介质中回收，但残余PN未直接定量，不能假定其保留在膜内。

3.4 去卵巢状态确认

所有去卵巢大鼠均表现预期的术后体重增加和处死时明显的子宫萎缩。与年龄匹配的假手术大鼠外部参考值相比，去卵巢大鼠股骨BMD在4周和8周分别降低约35%和46%，BV/TV降低约91%和82%，Tb.N降低约88%和80%，Tb.Sp增加约3.7–3.8倍，表明存在与雌激素缺乏骨质疏松状态一致的小梁骨明显丢失。

3.5 颅骨缺损micro-CT分析

4周时，所有组矿化组织主要位于缺损边缘，缺损中央大部分区域仍呈放射透光性。PN_Mem组缺损区内可见多个分散的小矿化灶，但尚未融合桥接缺损。各组骨体积和BMD均无显著差异（Control：1.57 ± 0.95 mm³；Mem：0.97 ± 0.64 mm³；PN_Mem：1.74 ± 0.92 mm³）。8周时，Control和Mem组缺损仍大部分未填充，新生矿化组织局限于缺损边缘和少量孤立岛。PN_Mem组显示广泛矿化组织延伸覆盖大部分缺损区域，骨体积（5.98 ± 2.20 mm³）显著大于Control组（1.24 ± 0.67 mm³；p < 0.0001）和Mem组（2.52 ± 1.79 mm³；p < 0.001），Control与Mem组间无显著差异。PN_Mem组BMD（0.90 ± 0.06 g/cm³）显著高于Mem组（0.81 ± 0.10 g/cm³；p < 0.05），两组与Control组（0.87 ± 0.11 g/cm³）均无显著差异。

3.6 组织学分析

4周时，Control组缺损主要由薄而疏松排列的纤维结缔组织占据，细胞稀少，新骨形成限于缺损边缘小区域。Mem组膜保持为致密层状胶原纤维带覆盖缺损，膜下组织为疏松结缔组织，新骨少。PN_Mem组缺损被明显更厚、细胞丰富的组织填充，膜残余碎片化并被细胞密集浸润，表明含PN胶原膜活跃的细胞浸润和重塑，但缺损中央尚未形成大量矿化骨。8周时，Control组缺损仅由薄层纤维结缔组织桥接，新骨仍限于缺损边缘。Mem组缺损中央由致密纤维结缔组织占据，新骨形成有限。PN_Mem组显示多个新形成骨岛分布于缺损各处，与缺损边缘宿主骨几乎连续，新骨由含骨细胞陷窝的小梁构成，含成熟骨基质和未成熟基质，表面覆盖有序纤维组织层。

3.7 免疫组织化学分析

4周时，各组BMP-2/4免疫反应均弱而弥散，PN_Mem组结缔组织内可见散在阳性细胞和局灶性强沉积。各组骨表面及邻近纤维组织中均存在Runx2阳性细胞核，Mem和PN_Mem组骨表面形成成排阳性细胞。Runx2阳性细胞核数（Control：57 ± 45；Mem：104 ± 43；PN_Mem：61 ± 43）和BMP-2/4相对染色强度（Control：46 ± 8；Mem：48 ± 9；PN_Mem：53 ± 8）组间均无显著差异。8周时，PN_Mem组BMP-2/4免疫反应在新形成骨小梁间的细胞性结缔组织和骨表面显著，Control组染色微弱，Mem组纤维组织中呈弥散中等强度。PN_Mem组Runx2阳性细胞在新形成骨周围纤维组织中密集积聚，Control和Mem组阳性细胞核较稀疏且主要沿骨表面分布。PN_Mem组Runx2阳性细胞核数（104 ± 47）显著大于Control组（58 ± 21；p < 0.05）和Mem组（44 ± 22；p < 0.01）。PN_Mem组BMP-2/4相对染色强度（79 ± 25）显著高于Control组（53 ± 11；p < 0.05），与Mem组（58 ± 25）差异不显著。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究结果支持研究假设，但再生效应主要在愈合后期显现。4周时各组骨体积无显著差异，而8周时PN_Mem组骨体积约为Mem组的2.4倍、Control组的近5倍。组织学结果与micro-CT一致。值得注意的是，单纯胶原膜在两个时间点均未显著增加骨体积，这与去卵巢骨再生能力受损的报道一致，并强化了本研究的核心发现：在受损的骨质疏松条件下，传统胶原膜单独的屏障功能可能不足，而掺入PN等生物活性制剂可提供可测量的再生优势。

PN_Mem组4周时缺损被更厚、细胞更丰富的组织占据，膜残余碎片化并被细胞密集浸润，可能代表早期细胞募集和含PN膜的活动重塑，为后续成骨提供了组织环境。PN制剂的细菌内毒素水平仅为0.079 IU/mg（每膜5 mg PN约含0.4 IU），污染驱动的炎症反应不太可能完全解释该细胞反应。PN的再生效应可能涉及核苷酸补救途径、腺苷A2A受体信号激活、VEGF表达增强的血管生成反应及炎症调节等机制，但PN与PDRN是不同制剂，PDRN已确立的机制不能直接推及PN。8周时PN_Mem组Runx2阳性细胞显著增多、BMP-2/4免疫反应增强，与更大的骨体积一致，但这些标志物可能是骨形成增加的结果而非原因，本研究未测试PN是否通过BMP、Runx2、腺苷受体或任何其他特异性信号通路起作用。

与现有再生策略相比，含PN胶原膜可能在成骨刺激和治疗复杂性之间提供不同平衡。重组BMP-2具有强效骨诱导活性但受剂量优化、载体依赖性释放、高成本和不良反应（术后水肿和异位骨形成）制约。PN不太可能作为类似BMP-2的单一强效骨诱导信号，其潜在优势可能在于通过影响细胞活性、血管生成、基质形成和炎症调节提供更广泛且可能更温和的再生刺激。本研究的独特之处在于胶原膜同时充当GBR屏障和PN的唯一局部载体，不伴随骨移植材料，并首次在骨质疏松条件下评估了膜递送高分子量PN的效应。

研究局限性包括：双侧缺损设计可能导致PN向对侧缺损扩散，若存在则预期缩小而非夸大组间差异；治疗采用固定循环序列分配而非随机化，操作者未设盲，但所有结局评估均设盲，统计模型纳入动物随机效应；动物在约7周龄去卵巢、4周后行颅骨手术，骨骼生长仍在进行，不能完全模拟绝经后骨质疏松的生物学背景；未设假手术或非去卵巢对照组，无法确定PN是否将骨愈合恢复至正常非骨质疏松水平；颅骨缺损模型在血管供应、机械负荷和周围解剖方面不同于牙槽骨和种植体周围缺损，不能直接外推至临床GBR；仅评估单一PN剂量（约5 mg/膜），无法评估剂量–反应关系；释放研究使用PBS不含蛋白水解酶，未模拟体内酶性胶原降解；机制解释主要限于Runx2和BMP-2/4免疫组织化学，未进行受体阻断实验、血管生成标志物、炎症细胞表征或腺苷信号直接评估；仅在4周和8周评估愈合，再生骨的耐久性、后续重塑和膜长期命运未知。

研究结论为：通过简单滴加方式将高分子量PN掺入胶原膜后，PN呈双相释放，并在去卵巢大鼠颅骨缺损中于8周时显著增加骨再生，优于不填充缺损或单纯传统胶原膜。更大的骨体积伴随跨缺损分布的新骨岛、更多的Runx2阳性细胞和强于不填充缺损的BMP-2/4免疫反应，与更具成骨性的局部环境一致，但潜在机制尚未确定。含PN胶原膜可能是一种值得进一步研究的简单策略，用于骨质疏松条件下的引导骨再生。然而，这些发现来自非负重颅骨模型，在推断临床相关性之前，需进行剂量优化并在牙槽骨或种植体周围缺损及更大动物模型中验证。