《Bioengineering》：Precision-Cut Liver Slices as a 3D Tissue Model for Assessing Warm Ischemia-Damaged Rat Livers After Normothermic Machine Perfusion
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常温机械灌注（normothermic machine perfusion, NMP）能够在移植前对器官进行评估并进行治疗干预。传统上，评估治疗效果需要实施全器官移植，这引发了伦理和资源方面的担忧。精密切割肝切片（precision-cut liver sli
常温机械灌注（normothermic machine perfusion, NMP）能够在移植前对器官进行评估并进行治疗干预。传统上，评估治疗效果需要实施全器官移植，这引发了伦理和资源方面的担忧。精密切割肝切片（precision-cut liver slices, PCLS）是一种成熟的离体三维组织模型，但其在NMP后的应用价值尚未被阐明。研究人员研究了NMP后制备的PCLS是否保持存活并能反映供体器官的损伤状态。大鼠肝脏被分为四组（每组n=4）：天然对照组、热缺血损伤模型组，以及相应接受6小时NMP的处理组。PCLS培养48小时，并在2、24和48小时取样。评估了损伤标志物、合成功能、代谢活性、炎症与氧化应激基因表达以及组织学变化。通过NMP期间灌注液中损伤标志物升高证实了热缺血损伤的诱导。在培养48小时后，未灌注的损伤模型切片中的丙氨酸氨基转移酶仍显著高于对照组。天冬氨酸氨基转移酶和乳酸脱氢酶无显著差异。代谢活性和尿素释放持续至48小时。TUNEL阳性在2小时时能够区分损伤组与对照组切片，但在48小时时趋于一致。NMP后制备的PCLS保持存活，并保留了可测量的损伤及灌注相关差异，从而建立了一种符合3R原则的新型灌注研究平台。
**论文解读：精密切割肝切片作为常温机械灌注后热缺血损伤大鼠肝脏的三维组织模型**
**1. 研究背景与问题**
肝移植是急性或慢性肝衰竭以及部分肝癌的唯一根治性治疗手段。然而，供肝需求远超过全球供给，许多患者在等待名单上死亡。为扩大供肝来源，来自老年供者或循环死亡后捐献（donation after circulatory death, DCD）的边缘性移植物被越来越多地使用，但这类器官固有的风险较高。与脑死亡后捐献（donation after brain death, DBD）不同，DCD不可避免地使器官经历一段热缺血时间，期间ATP依赖性细胞过程失效、活性氧积累、炎症级联反应启动，进而导致缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, IRI），损害移植物功能，增加原发性无功能和缺血性胆管病的风险。常温机械灌注（normothermic machine perfusion, NMP）通过在生理温度下以含氧、富含营养的灌注液维持器官代谢，成为一种有前景的保存策略。NMP能够在接近生理条件下评估移植物，并为主动再调理提供治疗窗口。然而，NMP调节炎症和恢复缺血损伤器官肝细胞功能的潜在机制仍不完全清楚，且缺乏稳健的实验平台来研究这些过程。精密切割肝切片（precision-cut liver slices, PCLS）是一种成熟的离体组织模型，保留了肝脏天然的三维细胞构筑，包括肝细胞、库普弗细胞、肝星状细胞和肝窦内皮细胞在生理空间关系中的完整细胞组成。这种多细胞完整性使PCLS区别于解离细胞培养系统，特别适合研究组织水平的复杂反应。然而，PCLS尚未被系统应用于评估NMP的组织水平效应，尤其是在缺血损伤器官背景下。因此，本研究旨在探究NMP后制备的PCLS是否保持存活、能否反映供体器官的损伤状态，并验证其作为替代全器官移植的3R合规研究平台的可行性。
**2. 研究设计与技术方法**
研究人员将16只大鼠肝脏分为四组（每组n=4）：对照组（Control）、对照+NMP组（Control + NMP）、损伤模型组（Damage Model）和损伤模型+NMP组（Damage Model + NMP）。损伤模型通过心脏穿刺放血诱导循环死亡，随后经历平均22±3分钟的热缺血。NMP组接受6小时双血管常温机械灌注（门静脉和肝动脉）。非灌注组在冷保存（Custodiol?）中维持与相应NMP组相近的冷缺血时间。PCLS从肝左叶和尾状叶制备，使用振动切片机切成250 μm厚度、8 mm直径的切片，置于12孔板中在 rocking platform 上连续供氧（95% O2/5% CO2, 37°C）培养48小时。评估的指标包括：培养液中的肝细胞损伤标志物（ALT、AST、LDH）、合成功能（尿素、白蛋白）、代谢活性（alamarBlue法）、炎症和氧化应激基因表达（IL-1α、IL-6、TNF-α、HO-1，通过RT-qPCR）、组织学（H&E和TUNEL染色）。样本在2、24、48小时采集。统计分析采用双因素方差分析或混合效应模型，设置时间作为肝内因素、组别作为肝间因素。
**3. 主要研究结果**
**3.1 NMP期间灌注动力学**
在6小时NMP期间，两组（Control + NMP和Damage Model + NMP）的灌注压力均维持在生理范围内，门静脉压力始终低于10 mmHg。损伤模型组的动脉压在前2小时倾向于高于对照组，可能反映了损伤移植物肝内血管阻力增加。损伤模型组的灌注液中AST、ALT和LDH浓度在所有时间点均显著高于对照组，且这种差异在灌注开始后数分钟的首次采样时已存在。例如AST初始值：损伤模型组318.5±131.5 U/L vs 对照组38.5±9.8 U/L。这表明DCD损伤模型诱导了明显的肝细胞损伤，并在NMP全程中与灌注对照组保持显著区别。
**3.2 PCLS体外损伤标志物**
在培养2、24、48小时，所有组的ALT、AST和LDH浓度均在24小时达到峰值，48小时下降。组间差异仅在48小时的ALT达到统计学显著：未灌注损伤模型组的ALT浓度显著高于对照组和Control + NMP组（p=0.0088和p=0.0085）。值得注意的是，Damage Model + NMP组的ALT在此时间点未升高，而是与对照组相当，提示先前的NMP减弱了损伤移植物后续的肝细胞酶释放。AST和LDH未见显著的组间差异。
**3.3 代谢活性和合成功能**
代谢参数主要在两个损伤模型组之间出现分歧，而非损伤与未损伤组织之间。未灌注损伤模型组在所有时间点乳酸浓度最低，并保持净葡萄糖释放，表明整体底物周转率低下。相比之下，Damage Model + NMP组在24小时和48小时乳酸浓度最高，同时伴有明显的净葡萄糖摄取，表明向糖酵解代谢的转变（损伤模型 vs 损伤模型+NMP，24小时p=0.0014，48小时p=0.0004）。尿素浓度在24小时达到峰值，各组间无显著差异，表明所有条件下尿素生成均得以保留。代谢活性同样在Damage Model + NMP组最高，且随时间在所有组中下降。
合成功能方面，白蛋白mRNA表达在对照组最高，与Control + NMP在2小时和24小时显著不同，与损伤模型组在24小时显著不同（p=0.0001）。但在蛋白质水平，所有组从2小时到24小时的培养基白蛋白浓度均相当增加，无显著组间差异。因此，各组的白蛋白分泌均得以维持，尽管损伤组织的转录活性较低。
**3.4 炎症和氧化应激基因表达**
促炎细胞因子IL-1α的表达在2小时时未灌注损伤模型组最高，灌注在对照和损伤模型背景下均降低了其表达（损伤模型 vs 损伤模型+NMP在2小时，p=0.0032）。IL-6的表达在各组和时间点相当，无显著差异。对照组（未灌注）的TNF-α表达在所有组中最低，与Control + NMP在2小时和24小时显著不同（p=0.0038和p=0.0250），与未灌注损伤模型组在2小时显著不同（p=0.0126）。因此，机器灌注和热缺血均与未处理对照相比增加了TNF-α表达。HO-1（HMOX1）的表达在24小时差异最明显，此时Damage Model + NMP组的HO-1表达显著最低（损伤模型 vs 损伤模型+NMP，p=0.0034）。
**3.5 组织学**
H&E染色显示，所有组在所有时间点的整体小叶结构均保留。肝细胞空泡化和肝窦间隙增宽在各组中不同程度存在，无一致的组间模式。所有组沿切割表面均存在薄层坏死，与切片机械损伤一致。TUNEL染色在2小时时对照组最低，未灌注损伤模型组最明显，与施加的热缺血损伤一致。在代表性切片中，Damage Model + NMP组在2小时和24小时的TUNEL阳性核少于未灌注损伤模型组，提示灌注降低了细胞死亡。然而，TUNEL染色为定性评估，未定量。到48小时时，TUNEL信号在所有组中接近融合，组间不再可区分，因此组间组织学差异仅限于2小时至24小时窗口。
**4. 讨论与结论**
本研究确立了PCLS作为一种离体三维组织模型，用于研究机器灌注和热缺血损伤的大鼠肝脏。主要发现是，PCLS能够从对照和损伤肝脏中可重复制备，且在培养期间保持存活，损伤和灌注相关差异在切片水平可检测到。ALT、乳酸和葡萄糖消耗等定量读数在48小时培养期间保持显著的组间差异，表明该模型保留了对这些参数的区分能力。研究还观察到，灌注后的损伤组（Damage Model + NMP）表现出独特的特征：相对于未灌注损伤模型切片，其酶释放较低，代谢活性较高，HO-1表达最低，合成功能相对保留。这可能提示NMP介导的损伤组织稳定化，因为HO-1是应激诱导的细胞保护酶，其低表达与氧化应激的消退而非持续存在一致。
研究存在若干局限性：供体体重在各组间存在差异，损伤模型组来自较老、较重的血液供体动物（590–705 g），而对照组为230–350 g；Control + NMP组包含雌雄动物，其余组均为雄性；NMP组在6小时灌注后切片，而非灌注组在冷缺血期后直接切片，因此灌注组与非灌注组在切片前的间隔和温度条件不同；分配未随机化，且灌注损伤模型组的实验在其他组之后数月进行，不能排除批次效应；TUNEL染色为定性评估，未进行定量分析。
总之，该研究首次系统地将PCLS与机器灌注相结合，建立了新型离体平台，可在明确控制的离体条件下研究灌注的组织水平反应，无需进行全器官移植。由于单个灌注肝脏可产生多个切片并平行暴露于不同条件，该模型支持对灌注添加剂、药物和再调理策略进行可控、可重复且节省资源的筛选，并可用于炎症、氧化应激和代谢反应的机制研究。通过使一个供体器官服务于多个实验问题，该模型直接促进了符合3R原则的动物使用减少。未来工作需聚焦于方法标准化和延长培养窗口，例如通过培养基优化或微流控整合，以进一步扩大应用范围。
**研究结论**：本研究确立了精密切割肝切片作为一种有价值的离体三维组织模型，用于在组织水平上研究机器灌注和热缺血损伤的大鼠肝脏。PCLS能够从对照和损伤肝脏中可重复制备，并保持存活至少48小时。损伤和灌注相关的组间差异在切片水平可检测；虽然组织学差异在48小时趋于一致，但多个定量读数在整个培养期间保持区分能力。总体而言，将PCLS与机器灌注相结合，为肝脏保存研究中的组织水平研究提供了一个有前景的受控平台。
