《Agriculture》：Rhizosphere Soil Properties and Microbial Community Across an Apple Replanting Chronosequence
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苹果再植病害（Apple Replant Disease, ARD）源于根际微生物群落失调、化感物质积累及土壤理化性质退化，导致幼苗生长受阻并阻碍老果园更新。本研究以新植对照（CK）和2-7年连作苹果树（Y2-Y7）的根际土壤为对象，采用横断面空间换时间序列设
苹果再植病害（Apple Replant Disease, ARD）源于根际微生物群落失调、化感物质积累及土壤理化性质退化，导致幼苗生长受阻并阻碍老果园更新。本研究以新植对照（CK）和2-7年连作苹果树（Y2-Y7）的根际土壤为对象，采用横断面空间换时间序列设计，通过相对丰度扩增子测序表征了土壤理化性状及细菌（16S rDNA）和真菌（ITS）群落特征。结果表明，相较于CK，Y2-Y7土壤中碱解氮（AN）、有效磷（AP）、全氮（TN）、全钾（TK）、有效锌（AZn）和有效铜（ACu）浓度显著降低，而交换性镁（Ex-Mg）升高。测序共获得5883个细菌和2063个真菌ASVs（Amplicon Sequence Variants）。Y2-Y7土壤中Bacillota和Pseudomonadota的相对丰度升高；所有样品中子囊菌门（Ascomycota）占据主导地位。各处理间细菌α多样性无显著差异，但长期连作（Y5-Y7）土壤的细菌β多样性显著区别于CK。土壤养分与细菌群落结构相关；针对真菌的部分Mantel检验仅呈现趋势水平关联，与整体真菌PERMANOVA（p = 0.08）的非显著性结果一致。本研究探讨了2-7年苹果连作时间序列中根际土壤属性与微生物组成之间的关联，提供了将微生物组成变化与土壤养分有效性相联系的关联证据，为理解连作果园根际微生物组-土壤相互作用建立了基线。
研究背景与科学问题
苹果再植病害（Apple Replant Disease, ARD）由根际微生物群落失调、化感物质积累及土壤理化性质退化共同引发，导致幼苗生长受抑并严重制约老龄果园的更新换代。尽管已有研究证实ARD是土壤-植物-微生物连续体中多组分交互调控的结果，其中特定有害病原微生物如镰刀菌属（Fusarium）、疫霉属（Phytophthora）和腐霉属（Pythium）在根际土壤中的富集被广泛认为是ARD的关键生物驱动因子，然而关于“连作年限与ARD严重程度之间的相关性”的系统研究仍十分有限，这阻碍了对病害发展关键阶段的识别，并增加了果园管理中实施分阶段防控策略的复杂性。同时，现有研究尚未阐明连作条件下根系代谢物、微生物与土壤养分之间的互作通路，特别是土壤因子如何驱动微生物群落组装进而影响ARD发生的机制认识仍然不足，从而限制了靶向微生态管理策略的开发。
研究设计与主要发现
为填补上述空白，研究人员聚焦于代表2-7年连作时间序列的苹果园，通过比较新植与连作果园的土壤，整合高通量测序与理化分析，系统表征了该时间序列下根际细菌和真菌群落的组成模式，并筛选出与微生物群落组成相关的土壤理化因子及LEfSe候选分类单元。研究在甘肃省静宁县（35°N, 105°E）进行，所有实验果园均位于单一连续生产区域（半径10公里内），土壤为黄土母质发育的砂壤土，采用雨养种植模式。共设置6个离散连作年限处理：Y2（连作2年）、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7，并以新植果园作为对照（CK）。每个处理和对照包含3个独立生物学重复。研究发现，连作土壤中多个宏量和微量营养元素库较CK减少，而交换性镁（Ex-Mg）升高；大多数连作年份的土壤pH值显著低于CK。测序共获得5883个细菌和2063个真菌ASVs。在门水平上，细菌优势类群为Pseudomonadota、Bacillota、Chloroflexota、Actinomycetota和Acidobacteriota，其中Bacillota和Pseudomonadota在多数连作位点相对丰度高于CK；真菌群落则以子囊菌门（Ascomycota）在所有样品中占绝对优势，而被孢霉门（Morireilomycota）为次优势类群，且在CK中相对丰度显著更高。细菌α多样性在各处理间无显著差异，但细菌β多样性显示长期连作（Y5-Y7）土壤与CK显著分离（PERMANOVA R2=0.574, p=0.0001），表明连作显著重塑了土壤细菌集合群落；而真菌群落整体响应较弱且不显著（R2=0.395, p=0.08）。LEfSe筛选分析（LDA阈值≥2.0）在不同对比组中鉴定出若干候选差异分类单元，但鉴于每组仅3个生物学重复，这些结果被视为探索性分类筛选而非确证性差异丰度推断。偏Mantel检验表明，土壤氮有效性轴（N-axis，即通过主成分分析将全氮TN和碱解氮AN合并的复合预测因子，Mantel's r=0.428, p=0.001）、交换性镁（Ex-Mg, r=0.369, p=0.008）和土壤有机质（SOM, r=0.352, p=0.001）与细菌群落组成显著相关，而pH仅呈趋势水平关联（r=0.220, p=0.052）；对于真菌，仅N-axis（r=0.180, p=0.022）和pH（r=0.240, p=0.038）达到显著水平。留一预测变量敏感性分析证实了上述排序的稳定性。
关键技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：1）横断面空间换时间序列设计，在甘肃省静宁县（35°N, 105°E）同一连续生产区域内选取新植对照（CK）和2-7年连作（Y2-Y7）苹果园，所有果园均为黄土母质砂壤土、雨养种植模式，统一使用‘长富2号’富士（Malus × domestica Borkh. f. domestica）接穗嫁接于山定子（Malus baccata）砧木上，并执行标准化农艺管理；2）土壤理化性质测定，包括半微量凯氏定氮法测全氮（TN）、碱解扩散法测碱解氮（AN）、硫酸-高氯酸消解-钼锑抗比色法测全磷（TP）、碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法（Olsen-P）测有效磷（AP）、火焰光度法测速效钾（AK）、重铬酸钾氧化-外加热法（Walkley-Black法）测土壤有机质（SOM）、DTPA提取-原子吸收光谱法（AAS）测有效锌（AZn）和有效铜（ACu）、乙酸铵提取-AAS法测交换性钙（Ex-Ca）和交换性镁（Ex-Mg），以及玻璃电极pH计测土壤pH；3）微生物扩增子测序，针对细菌16S rRNA V4区（引物515F/806R）和真菌ITS1区（引物ITS1F/ITS2）进行PCR扩增，在Illumina MiSeq PE300平台测序，经QIIME 2流程（DADA2插件）推断ASVs，分别基于SILVA 138.99和UNITE 8.3数据库进行分类注释；4）统计与生物信息学分析，包括单因素方差分析/非参数检验比较土壤理化性质和α多样性指标，基于Bray-Curtis距离矩阵的主坐标分析（PCoA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）评估β多样性，为解决TN和AN严重多重共线性（r=0.961, VIF>10）而采用主成分分析（PCA）合并为氮有效性轴（N-axis），偏Mantel检验评估环境因子与群落组成的关联，以及LEfSe分析（LDA阈值≥2.0）进行探索性差异分类单元筛选。
研究结果详述
3.1 土壤理化性质分析：与CK相比，所有连作位点的碱解氮（AN）、全氮（TN）、全钾（TK）、有效磷（AP）、有效铁（AFe）、有效铜（ACu）和有效锌（AZn）含量均显著降低；交换性镁（Ex-Mg）含量显著升高；除Y2和Y4外，其余连作位点土壤pH均显著低于CK，且从连作第三年起pH呈逐渐下降趋势；Y7的土壤有机质（SOM）显著高于CK，而其他连作位点SOM均显著低于CK；交换性钙（Ex-Ca）在各采样点间无显著差异。
3.2 测序输出与ASV概况：细菌16S rRNA测序获得1757460条原始读段，最终得到385057条非嵌合读段，聚类为5883个细菌ASVs；真菌ITS测序获得1782041条有效序列，最终得到1754061条高质量读段，聚类为2063个真菌ASVs。所有采样点共享23个细菌ASVs和82个真菌ASVs。
3.3 根际土壤微生物群落组成分析：在门水平，细菌优势类群为Pseudomonadota、Bacillota、Chloroflexota、Actinomycetota和Acidobacteriota，其中Bacillota和Pseudomonadota为绝对优势类群，在Y6和Y4的相对丰度分别达72.01%和61.54%；真菌群落以子囊菌门（Ascomycota）在所有采样点占绝对优势，被孢霉门（Morireilomycota）为次优势类群，且在CK中相对丰度显著高于其他位点。在属水平，核心细菌属如鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、Dongia、Ellin6055和Novosphingobium在CK至Y7间波动较小，未检测到明显方向性变化；而真菌属中，镰刀菌属（Fusarium）在CK至Y4期间相对丰度保持在40%以上，但在Y6和Y7显著下降，而被孢霉属（Mortierella）、Linnemannia和Enterocarpus在Y4-Y7连作土壤中较CK更为丰富。
3.4 根际微生物群落多样性分析：α多样性方面，不同采样点间的细菌香农指数（Shannon, p=0.412）、Chao1指数（p=0.221）、辛普森指数（Simpson, p=0.367）和观测ASVs数（Observed, p=0.298）均无显著差异；真菌的各项α多样性指数亦无显著差异。β多样性方面，细菌群落的PCoA前两轴分别解释总变异的16.7%和13.3%，PERMANOVA显示连作时间序列与细菌群落组成显著关联（R2=0.574, p=0.0001），CK和Y2紧密聚集，Y3-Y4形成中间簇，长期连作（Y5-Y7）与CK和短期连作组沿排序轴明显分离；真菌群落的PCoA前两轴解释总变异的43.9%和11.9%，但PERMANOVA显示整体差异不显著（R2=0.395, p=0.08）。
3.5 LEfSe筛选的探索性差异微生物分类单元：在CK与Y2对比中，4个细菌属和5个真菌属通过筛选；在Y2与Y7对比中，12个细菌属被鉴定为显著生物标志物，但真菌分类单元未通过筛选；在CK与Y2-Y7合并对比中，12个细菌属和2个真菌属被富集。所有LEfSe结果因每组仅3个生物学重复而被视为探索性分类筛选。
3.6 土壤理化性质与根际微生物群落的相关性：Pearson相关分析显示TN与AN强正相关（r=0.961, p<0.001），经PCA合并为N-axis（捕获98.05%总变异）后，偏Mantel检验表明N-axis（r=0.428, p=0.001）、Ex-Mg（r=0.369, p=0.008）和SOM（r=0.352, p=0.001）与细菌群落组成显著相关，pH仅呈趋势水平（r=0.220, p=0.052）；对于真菌，仅N-axis（r=0.180, p=0.022）和pH（r=0.240, p=0.038）达到显著，而SOM和Ex-Mg不显著。留一预测变量敏感性分析确认了上述排序的稳健性。
3.7 微生物聚类热图分析：属水平的聚类热图显示，CK中链霉菌属（Streptomyces）、Terrimonas和Niastella相对丰度较高；Y7处理组中Nitrolancea、芽单胞菌属（Gemmatimonas）和Bauldia丰度升高；Y3处理组中Faecalibacterium、Blautia和Romboutsia相对丰度高于CK；Y4、Y5和Y6处理组中Romboutsia和Bacteroides丰度较高。真菌方面，CK中被孢霉属（Mortierella）、Dactylonectria和赤霉菌属（Gibberella）维持较高相对丰度；Y2处理组中节丛孢属（Arthrobotrys）和枝顶孢属（Acremonium）丰度较高；Y6处理组中头束霉属（Cephalotrichum）和球囊霉属（Glomus）丰度升高；Y7处理组中Calcarisporiella、根孢囊霉属（Rhizophagus）和Kernia丰度较高。
讨论与结论
讨论部分指出，连作导致土壤pH下降，这与酸性功能基团累积有关，但本研究碱性基线（7.97-8.42）处于苹果栽培适宜性上限，pH下降0.3-0.5个单位使土壤趋近但未进入通常报道的酸性范围。碱解氮（AN）和有效磷（AP）的持续下降可能反映了连作下矿化作用受损，但缺乏直接速率测量证据。交换性镁（Ex-Mg）的同时增加可能涉及四种非排他性假说：pH下降增强风化释放、长期有机肥和高钾肥输入、连作胁迫下根系吸收减少以及黄土母质的高镁背景。微生物群落方面，细菌α多样性稳定而β多样性显著变化，表明发生的是分类单元替换而非增减；真菌群落对连作的响应远弱于细菌。偏Mantel分析揭示了土壤氮有效性（N-axis）、pH和交换性镁（Ex-Mg）是关联微生物群落变异最强的变量，其中Ex-Mg是此前被忽视的因素。属水平分析显示核心细菌属保持稳定，而真菌属中镰刀菌属（Fusarium）在短中期连作中高丰度但在长期连作中下降，这可能反映群落组成再平衡，但无法从相对丰度数据区分病原负荷的真实降低还是组成性调整。
研究结论：通过比较CK与2-7年连作苹果树根际土壤的理化性质和微生物群落结构，本研究表明：相对于CK，连作土壤中多个宏量和微量营养元素库减少，交换性镁（Ex-Mg）升高，大多数连作年份土壤pH显著降低；土壤pH、交换性镁及复合土壤氮有效性轴（N-axis，通过PCA合并TN和AN）与细菌群落组成显著相关。细菌集合群落表现出显著的组成周转（PERMANOVA R2=0.575, p=0.001），尽管样方内丰富度未变，而真菌群落响应极弱且不显著（R2=0.383, p=0.145）。由此得出三点结论：第一，沿2-7年连作时间序列，持续连作与土壤pH渐进性下降、交换性镁同步增加以及多个宏量和微量营养元素库相对于CK的减少相关联；由于无法重建每个果园的历史施肥记录，这些营养库比较被解释为观察性关联而非连作诱导营养耗竭的受控证明。第二，pH、N-axis和有机质是与微生物群落变异关联最强的变量。第三，细菌群落在不同连作年限类别间比真菌群落更易区分，后者在α多样性和整体组成上保持相对稳定。这些结论基于横断面时间序列，需要通过纵向或操纵性实验加以验证。
