《Proteomes》：Decoding Emerging Protein Post-Translational Modifications Through Chemical Biology
蛋白质翻译后修饰（PTMs）通过调控蛋白质活性、定位、稳定性及分子间相互作用，极大地扩展了蛋白质组的复杂性。尽管质谱技术的进步使得经典PTMs的大规模表征成为可能，但对新鉴定的稀有修饰的发现与分析仍面临技术挑战，原因在于其丰度有限、动态变化以及缺乏稳健的富集方法。近年来，化学生物学的进展提供了强有力的互补性方法，通过利用PTMs的化学反应性、代谢来源或酶促安装特性，克服了上述诸多局限。本综述总结了加速新型蛋白质PTMs及其所生成蛋白质变体（proteoforms）的图谱绘制与功能表征的新兴化学生物学策略。研究人员讨论了利用生物正交代谢物模拟物的代谢标记、内源性PTMs的化学选择性衍生化、用于位点特异性PTM鉴定的可裂解富集策略、用于发现PTM相关蛋白质相互作用的邻近标记方法，以及通过遗传密码扩展（GCE）和化学连接实现位点特异性PTM安装的方法。研究人员进一步重点介绍了代表性应用，展示这些技术如何促成了此前未被识别PTMs的发现、改进了全蛋白质组图谱绘制、鉴定了PTM阅读器（readers）、书写器（writers）和擦除器（erasers），并推动了多种生物学与疾病背景下的机制研究。最后，研究人员讨论了当前方法的优势与局限，并展望了将化学生物学与定量蛋白质组学、单细胞分析及人工智能驱动的数据解读相结合的未来方向。总之，这些互补性技术正在重塑蛋白质PTMs的研究，并将继续推进对健康与疾病中蛋白质组调控的理解。
1. 引言
经典蛋白质生物合成途径从根本上局限于二十种氨基酸，这为所得蛋白质组的化学多样性设定了内在上限。蛋白质翻译后修饰（PTMs）通过酶催化或自发非酶促反应，在翻译后扩展蛋白质组的化学库，由单一基因产物生成不同的蛋白质变体（proteoforms），从而部分克服了这一限制。尽管磷酸化、乙酰化和泛素化等许多PTMs已被广泛表征，但越来越多化学与功能各异的蛋白质修饰仍在不断被发现，其在转录调控、信号转导和疾病发病机制中发挥作用。这些新兴蛋白质PTMs相对于已被充分表征的对应修饰，通常具有低化学计量比和低丰度，因此需要先进的富集与检测策略以实现其系统表征。
在质谱分析之前进行富集是PTM图谱绘制的必要条件，即使对于丰度高且研究充分的修饰也是如此。历史上，两类方法主导了这一工作：利用特定PTMs诱导蛋白质产生的物理化学变化的亲和色谱，以及使用修饰特异性抗体的免疫沉淀。色谱方法对化学上具有独特性的修饰非常有效；然而，该方法本质上局限于那些能充分改变所修饰蛋白质物理化学性质以允许选择性捕获的PTMs。基于抗体的富集更广泛适用于PTM选择性捕获，但存在已有充分文献记载的分析缺陷，包括批次间变异性、依赖背景的表位识别以及显著的脱靶结合率。
作为替代方案，化学生物学方法，特别是基于生物正交化学的策略，为上述许多局限提供了解决方案。由于该领域的近期进展，利用基序特异性反应、酶工程、代谢物模拟物以及许多其他化学生物学方法来研究PTM蛋白质变体的互补技术出现了爆发式增长。许多此类方法不依赖抗体的非共价识别，而是直接利用PTM的化学反应性、代谢来源或酶促安装特性。此类策略可实现时间控制、改善分子定义以及选择性富集含PTM的蛋白质或肽段。重要的是，化学生物学工具并非旨在普遍替代传统富集方法；相反，它们提供了正交能力，对低丰度、动态或表征不足的PTMs尤为有价值。
与这些湿实验进展并行，计算和人工智能（AI）驱动的方法在PTM发现与验证中日益居于核心地位。基于深度学习的从头肽段测序和开放搜索算法提高了识别对应于新型或低丰度修饰的意外质量偏移的能力，减少了对限制性修饰特异性数据库搜索的依赖。在大规模PTM数据集上训练的机器学习模型还可预测修饰位点、功能后果和酶-底物关系，有助于优先选择候选物以进行靶向化学生物学验证。AI辅助分析并非作为独立解决方案，而是最好理解为富集化学的补充。计算工具可在规模上标记候选修饰和蛋白质上的修饰位点，而化学生物学策略则提供确认其生物学相关性所需的选择性、机制驱动的验证。
在本综述中，研究人员深入探讨了用于分析和研究新兴蛋白质PTMs的新型化学生物学方法，并将这些策略与互补的分析和计算进展并列，这些进展共同拓展了PTM蛋白质变体领域的发现前沿。
2. 用于PTM研究的经典蛋白质组学方法
PTM蛋白质组学的基础工作流程将富集步骤（色谱或免疫亲和）与最适合实验问题的质谱采集策略相结合。在后续章节所述化学生物学工具被广泛采用之前，这些富集方法是系统性地在全蛋白质组尺度上分析PTMs的主要手段。如引言所述，色谱富集对赋予修饰肽段足够独特物理化学变化的PTMs有效。磷酸肽通过磷酸基团对金属离子的亲和力被IMAC或TiO
2色谱选择性捕获，而糖肽可基于其亲水性和碳水化合物识别相互作用通过凝集素亲和色谱或亲水相互作用液相色谱（HILIC）富集。然而，这些方法本质上具有PTM特异性，缺乏对修饰蛋白质组的通用性，因为它们需要已知的高亲和力捕获相互作用或足以区分修饰与未修饰蛋白质或肽段的物理化学性质。
使用修饰特异性抗体的免疫亲和富集提供了比色谱更广泛PTM覆盖的替代方案，并且一直是在蛋白质组尺度上分析赖氨酸乙酰化、甲基化和泛素化等标记的主导方法。抗体的实际多功能性，例如其在蛋白质印迹、免疫沉淀、流式细胞术和富集工作流程中的适用性，促成了其在PTM修饰蛋白质研究中的广泛采用。然而，基于抗体的方法具有该方法本身固有的、已有充分文献记载的分析局限性。对商业抗体的系统评估发现，约25%未通过特异性验证，20%在染色质免疫沉淀测定中无功能。在分子水平上，抗体识别依赖于在侧翼蛋白质序列背景下与修饰表位的非共价结合，这意味着特异性本质上易受相邻氨基酸残基的位阻和静电效应影响，从而在位点鉴定中引入系统性偏差。其他局限性包括抗体性能的批次间变异性、缺乏时间分辨率、修饰特异性抗体开发耗时，以及无法区分在不同位点安装相同化学修饰的不同书写器酶的活性。
还必须提及基于凝胶的平台，尤其是高分辨率二维凝胶电泳（2DE），其直接利用等电点和分子量分离完整蛋白质变体，完全绕过了对PTM特异性捕获试剂的需求。当与完整质量鉴定结合时，基于2DE的工作流程可在不依赖已知亲和相互作用的情况下确定PTM身份，并继续在完整蛋白质组范围内提供可实现的最高蛋白质变体分辨率。事实上，近期对优化的2DE/LC-MS/MS自上而下蛋白质组学工作流程的定量评估已证实，这种联用代表了在其组成蛋白质变体水平上广泛且深入解析蛋白质组的最有效方法。PTM特异性凝胶内荧光染色进一步使2DE能够选择性地应用于修饰亚蛋白质组（例如针对磷蛋白和糖蛋白的特异性染色），而无需质谱进行初步检测。
近期方法学改进已直接解决了历史上与2DE相关的若干局限。优化的样品还原方案显著提高了可分辨斑点计数并减少了拖尾，基于凝胶的预分级策略如PEPPI-MS将完整蛋白质变体和蛋白质复合物分析扩展到原本因复杂性而丢失的物种，通过组合肽配体文库进行动态范围压缩在电泳前揭示低丰度物种，以及通过高通量MALDI-TOF/IEF工作流程实现下游鉴定自动化，已开始缩小与基于LC-MS/MS方法的通量差距。尽管有这些进展，凝胶电泳仍存在一些局限。与本综述中提到的许多其他技术相比，凝胶电泳通量较低。由于凝胶电泳所使用的分离方法，该技术对非常大、非常小、高度疏水或等电点极端的蛋白质表现不佳。同样重要的是，如果目标是根据特定PTM而非单个蛋白质变体分离蛋白质组，凝胶电泳并非最优技术，因为它区分修饰与未修饰蛋白质，但不基于PTM分离蛋白质。
定量蛋白质组学策略包括细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）和同量异序串联质量标签（TMT）标记，它们并非作为富集工具发挥作用，而是实现跨实验条件的PTM蛋白质变体比较丰度分析。这些方法已被应用于表征药理学扰动响应、细胞信号级联过程中、受控蛋白质降解条件下以及不同细胞生长状态下的PTM动态。定量蛋白质组学的当代进展集中于将这些标记策略与新型富集工作流程整合，以及开发改进试剂以提高多重能力、定量准确性和与低输入样品的兼容性。
3. 用于PTM研究的化学生物学工具与方法
以下章节按方法学途径组织，讨论用于PTM图谱绘制的最具代表性的化学生物学策略。每种策略均就其化学逻辑、在PTM领域的代表性应用及固有局限进行考察。
3.1. 利用代谢物模拟探针对靶PTMs进行代谢标记
大多数PTMs由酶安装或以非酶促方式添加到蛋白质上，基于内源性小分子底物，如酰基辅酶A硫酯、SAM、核苷酸糖或氨基酸衍生物，其在细胞中的普遍性使得对所得修饰的选择性靶向在分析上具有挑战性。即使是用于新型PTMs的分子，如单胺化，也来源于内源性过程或饮食。生物正交代谢物模拟物通过引入内源性底物的结构类似物来解决选择性问题。该模拟物含有反应性官能团，最常见的是叠氮化物或末端炔烃，这些在生物环境中不存在，因此适合通过生物正交点击化学反应进行选择性共价捕获。关键设计要求是点击手柄引入的结构扰动不会显著损害相关酶利用该类似物作为底物修饰蛋白质组的能力。
在Bertozzi于2000年代初奠定生物正交化学基础之后，代谢标记工作流程被多个研究组迅速应用于PTM蛋白质组学。这些论文最终使该领域汇聚于一个共同的操作范式：将类似物给予培养细胞或生物体，允许时间使其酶促掺入目标PTM，在变性条件下裂解细胞，并通过点击反应（如铜催化叠氮-炔环加成（CuAAC）或应变促进[3+2]环加成（SPAAC））使用生物素化点击试剂共价捕获修饰的蛋白质或肽段，以便在质谱鉴定前进行基于链霉亲和素的亲和富集。该方法已被应用于分析许多成熟PTMs，包括O-GlcNAc糖基化、S-棕榈酰化和乳酸化，并且最近使得新兴修饰的表征成为可能。
乳酸化，即由乳酸衍生的乳酰基对赖氨酸残基的酰化，是代谢标记如何驱动新型PTM功能表征的一个引人注目的例子。最初被鉴定为能够激活基因表达的组蛋白修饰，鉴于Warburg效应驱动的肿瘤细胞内乳酸升高，乳酸化在肿瘤学中尤为重要。将炔烃官能化乳酸类似物引入细胞使得乳酸化位点的全蛋白质组图谱绘制成为可能，在62种蛋白质中鉴定了114个修饰位点。其中，PARP1随后被验证为生理相关的乳酸化底物，乳酸化PARP1蛋白质变体被证明增强ADP-核糖基化活性，并将乳酸化与DNA修复调控联系起来。
代谢标记在表征生物学上重要的组蛋白单胺化类别中也发挥了重要作用，该类修饰是转谷氨酰胺酶介导的生物胺（包括血清素、多巴胺和组胺）与组蛋白尾部谷氨酰胺残基的偶联。使用生物正交胺类似物结合化学蛋白质组学，转谷氨酰胺酶2被鉴定为不仅是组蛋白H3单胺化的书写器，还作为这些修饰的擦除器和交换器发挥作用。这些修饰（具体为组胺化和血清素化）进一步被证明调控昼夜节律基因的表达。
代谢标记的效用通过其与不同化学生物学方法的兼容性而进一步增强。酶工程策略可扩展生物合成酶对结构庞大生物正交类似物的底物耐受性，这些类似物不会被内源性酶利用来修饰蛋白质组。例如，GalNAc转移酶的结构引导诱变使得能够掺入野生型酶会拒绝的空间位阻GlcNAc类似物，允许对单个转移酶蛋白质变体的O-GalNAc糖基化底物进行选择性全蛋白质组图谱绘制。该研究利用额外的化学生物学方法学来提高探针生物利用度和细胞选择性。该方法学是前药样笼化策略的使用，其中类似物上的反应性或膜不可渗透官能团被保护基团掩蔽，这些保护基团在细胞内通过酶活性、pH依赖性水解或光化学脱保护去除。具体到上述GalNAc研究，核苷酸糖类似物磷酸氧上的S-酰基-2-硫代乙基（SATE）保护基被用于使探针具有细胞通透性，同时在细胞内被切割以释放活性底物。
类似的凹凸（bump-and-hole）策略已被应用于酰基辅酶A依赖性书写器。一组带有叠氮化物或炔烃手柄的乙酰辅酶A衍生物与活性位点扩大的赖氨酸乙酰转移酶（KAT）变体配对，产生能够在竞争性内源性乙酰辅酶A池存在下标记底物的生物正交酶-辅因子对。与3-叠氮丙酰辅酶A一起应用时，该方法将400多个候选底物分配给GCN5和p300，随后验证IQGAP1和SMC1为此前未识别的GCN5靶标。由于3-叠氮丙酰辅酶A被证明具有细胞通透性，该策略随后被扩展到活细胞中：工程化组蛋白乙酰转移酶（HAT1）变体结合SILAC蛋白质组学在其天然细胞环境中解析了123个HAT1特异性底物。同样的逻辑此后被转移到蛋白质S-酰基转移酶，其中“孔”ZDHHC突变体与“凸”脂质探针配对鉴定了300多个异构体特异性S-酰化底物。这种书写器解析的分析直接解决了第2节中提到的基于抗体富集的局限性，即无法区分在不同位点安装相同化学标记的不同书写器酶的活性。
这种代谢物模拟方法解决了第2节中提到的成熟方法所固有的许多基本问题。该方法通过脉冲-追踪实验具有时间分辨的潜力；最小的点击手柄显著减少空间位阻效应；由于化学结构明确，探针批次间无变异性；可与TMT等定量方法偶联；这些模拟物可被工程化以具有书写器特异性。尽管有这些优势，代谢标记仍受限于源于类似物与内源性代谢物之间结构不一致的固有局限。即使最小程度扰动的点击手柄的引入也会改变底物的空间和电子性质，这可能降低酶处理效率、扭曲底物选择性、改变类似物的体内代谢命运，或在达到充分标记效率所需浓度时引入细胞毒性效应。这些因素使得可能通过脱靶酶掺入类似物产生假阳性信号，以及由于内源性代谢物与模拟物之间不可避免的不完全竞争而产生假阴性结果。同样重要的是，修饰位点周围的区域可能影响点击反应可发生的水平。如果区域可及性较低，则蛋白质可能不会被鉴定到。因此，任何代谢标记探针的严格验证需要生化确认靶向酶促掺入、证明内源性底物的竞争性置换，以及验证代表性鉴定位点。
3.2. 使用生物正交探针对内源性PTMs进行化学衍生化
化学选择性衍生化为分析PTM修饰蛋白质提供了补充策略，其规避了将外源性代谢模拟物引入活细胞的要求。这些方法不依赖类似物的生物合成掺入，而是利用PTM本身的固有化学反应性，将可检测或可富集的标签直接安装到内源性修饰上。该方法保留了修饰的天然化学性质，避免了代谢标记固有的潜在生物学扰动。然而，由于反应必须在与蛋白质完整性兼容的条件下进行，同时对给定修饰具有高度选择性，它们经常需要非生理条件（金属催化剂、极端pH、亲核试剂），这些条件不能始终应用于完整细胞。
选择性是化学选择性衍生化的核心分析挑战。高度丰富的官能团如胺和硫醇遍布蛋白质组，因此需要高度特异性的化学试剂或保护-脱保护策略来区分目标PTM与背景反应性。化学选择性快速偶氮偶联反应（CRACR）用于血清素化分析提供了内在化学选择性的一个充分表征的例子。芳基重氮离子以pH依赖性方式与富电子芳香系统发生亲电偶联：在pH 9时，偶联以酪氨酸残基为主，而在pH 6-7时选择性转向含5-羟基吲哚的底物，包括谷氨酰胺血清素化中的血清素部分。这种差异反应性被利用来选择性标记细胞裂解物中的血清素化蛋白质，并分析结直肠癌细胞的血清素化蛋白质组。基于重氮盐的衍生化的化学范围随后被扩展到单甲基赖氨酸，通过在芳烃重氮盐骨架上引入给电子取代基，增加其对甲基化赖氨酸侧链弱亲核仲胺的亲电性。类似地，应变促进氧化控制的环辛炔-1,2-醌环加成（SPOCQ）通过多巴胺邻醌形式反应，使得多巴胺化蛋白质的化学选择性标记成为可能，该邻醌形式通过儿茶酚基团氧化产生。
对于涉及更常见官能团的PTMs，通常需要保护-脱保护策略来实现选择性。用于S-棕榈酰化分析的酰基-生物素交换（ABE）方法阐明了这一原理。首先用N-乙基马来酰亚胺封闭游离硫醇以防止非特异性反应。然后通过羟胺选择性切割棕榈酰修饰的硫酯键，释放原先酰化的半胱氨酸硫醇。未掩蔽的硫醇随后与生物素化硫醇反应性试剂缀合以进行亲和捕获。该方法的定量变体用基于碘乙酰胺的酰化位点识别试剂替代生物素标签，以实现棕榈酰化水平的基于凝胶的定量。类似的保护-脱保护或选择性衍生化策略已被开发用于糖基化、乙酰化、瓜氨酸化和S-亚硝基化。
尽管有这些优势，化学选择性衍生化如前所述仍从根本上受限于反应选择性。许多生物官能团在化学上相似且在蛋白质组中高丰度存在，导致大量脱靶反应。表观选择性也可能强烈依赖于缓冲液组成、pH、试剂浓度、反应时间和样品制备条件。反应必须足够温和以保持天然蛋白质结构，这限制了可实现的转化率，导致与内源性代谢物的不完全反应。因此，严格的对照至关重要，包括无试剂对照、省略关键激活或切割步骤、适用时的竞争实验、通过靶向质谱或生化测定验证，以及许多实验重复。在湿实验对照不足以充分消除偏差的情况下，严格的计算对照对于建立蛋白质组学数据的置信度很重要。化学选择性衍生化并非作为基于抗体或代谢标记工作流程的通用替代，而是类似于色谱方法，当应用于具有独特且实验可及的化学反应性的PTMs时最为强大。
3.3. 用于PTM位点分析的可裂解连接子
PTM蛋白质组学工作流程性能的一个关键但常被低估的组成部分是双功能化富集试剂的分子结构，该试剂将代谢探针或衍生化标签上的点击手柄连接到用于亲和捕获的链霉亲和素官能化分子。在其最简单形式中，该试剂在一端呈现与PTM探针上点击手柄互补的生物正交官能团，在另一端呈现生物素基团，使得探针标记的蛋白质能够基于链霉亲和素下拉，随后用胰蛋白酶消化并通过LC-MS/MS分析。虽然对PTM蛋白质水平鉴定有效，但这种结构对PTM位点定位存在根本性局限：在珠上胰蛋白酶消化后，带有富集试剂的修饰肽段通过生物素-链霉亲和素相互作用保持与珠共价连接，阻止其洗脱和质谱测序。在生物正交手柄与生物素基团之间引入化学可裂解连接子通过在限定条件下允许修饰肽段从固相支持物选择性释放解决了该问题，使得能够通过MS/MS碎片化直接鉴定修饰残基。
若干可裂解连接子化学已被开发用于PTM位点鉴定应用，每种具有不同的实际权衡。二烷氧基二苯基硅烷（DADPS）试剂已成为金标准，其掺入苯基硅烷部分，在温和酸性水溶液条件（例如10%甲酸）下发生水解切割，该条件与标准反相LC-MS/MS样品制备完全兼容。对主要可裂解富集架构的系统比较，如光可裂解试剂（Az-UV-biotin和Az-PC-biotin，通过UV照射切割）；肼可裂解试剂（Az-Dde-Biotin）；还原可裂解试剂（Az-Diazo-biotin，通过膦还原切割）；以及上述DADPS，表明DADPS实现了最高的PTM位点图谱绘制效率，在优化条件下覆盖所有连接子所发现总修饰肽段的96%。一种完全避免共价切割反应的替代策略使用脱硫生物素代替生物素作为链霉亲和素结合部分。脱硫生物素以显著低于生物素的亲和力结合链霉亲和素（K
d ~10
?11 M 对比 ~10
?15 M），使得脱硫生物素化肽段能够被游离生物素在简单洗脱步骤中竞争性置换，而无需化学切割反应。
每种可裂解富集策略都带有特定的技术局限，必须在目标PTM和下游分析工作流程的背景下加以考虑。光可裂解试剂和基于脱硫生物素的洗脱均易受不完全释放的影响，导致修饰肽段回收率降低。脱硫生物素富集进一步因细胞裂解物中内源性生物素化蛋白质和游离生物素的竞争而复杂化。该生物素可部分饱和链霉亲和素结合位点并阻止脱硫生物素化探针在洗脱步骤前的结合，鉴于脱硫生物素较弱的结合亲和力，这是比传统基于生物素的捕获更显著的问题。用于切割DADPS中苯基硅烷的酸性水解条件虽然相对于许多化学切割反应较为温和，但与酸不稳定PTMs如O-聚糖不相容，限制了其在糖蛋白质组学工作流程中的适用性。还原可裂解试剂需要高浓度还原剂（通常为TCEP或膦化钠）和高盐缓冲条件，需要在LC-MS/MS进样前额外脱盐步骤以防止离子抑制。适用于所有可裂解连接子策略的通用分析考虑是，切割留下残留质量加合物（连接子剩余在修饰残基上的残基），必须在数据库搜索参数中加以考虑。此外，该质量加合物可能改变肽段碎片化行为，从而影响序列覆盖或使谱图解读复杂化。尽管有这些局限，可裂解富集手柄策略代表了当前通过化学蛋白质组学进行PTM位点水平鉴定的方法学标准，因为没有替代方法能提供等效能力来在蛋白质组尺度上对富集肽段上的修饰位点进行直接、广泛适用的定位。
3.4. 用于PTM阅读器鉴定的邻近标记方法
一类方法学上不同的PTM研究化学生物学工具利用邻近依赖性酶促生物素化来绘制与特定PTMs相关的蛋白质相互作用景观，这些蛋白质与所述PTMs相互作用。邻近标记酶如生物素连接酶变体BioID、BioID2、TurboID和BASU，以及抗坏血酸过氧化物酶APEX2，催化生成短寿命、高反应性生物素中间体（分别为生物素酰-AMP或生物素-苯氧基自由基），共价标记约10 nm半径内的邻近蛋白质。通过遗传或生化方式将这些酶靶向到特定PTM位点，可以捕获修饰与其阅读器、书写器或擦除器蛋白质之间在标准条件下细胞裂解时丢失的瞬态和低亲和力相互作用。
邻近标记在PTM生物学中最概念直接的应用是鉴定给定PTM的阅读器蛋白质。ChromID平台例证了该方法：修饰选择性染色质阅读器结构域与生物素连接酶（BioID2或BASU）融合并在细胞中表达，导致特定组蛋白标记周围局部蛋白质组的生物素化。应用于H3K4me3时，ChromID鉴定了该标记处已建立的转录因子、染色质重塑复合物和组蛋白乙酰转移酶，以及此前未表征的候选阅读器蛋白质。基于抗体的变体AMAPEX（抗体介导的蛋白A-抗坏血酸过氧化物酶2标记）用抗体替代工程化阅读器结构域，使得无需表征的阅读器蛋白质即可在内源性修饰位点进行邻近标记。比较分析表明，AMAPEX实现了显著改善的标记蛋白质核定位（70%核内），相对于传统抗体-HRP方法（40%核内），反映了基于APEX2的标记更优越的空间分辨率。最近，Chroma-μMap将光催化邻近标记与修饰特异性抗体结合，实现了亚纳米标记半径，使得能够区分空间相邻组蛋白蛋白质变体处的阅读器复合物。
一种互补的非酶促阅读器鉴定策略使用合成PTM bearing肽作为光亲和诱饵，而非依赖遗传编码的邻近标记酶。在该方法中，合成带有目标PTM的组蛋白（或其他底物）肽，同时带有两个额外功能：光反应性交联基团，最常见的是二苯甲酮或双吖丙啶，以及用于下游生物正交缀合的末端炔烃手柄或生物素分子。与细胞裂解物或核提取物孵育并随后UV照射后，光反应性基团将瞬态、非共价阅读器-PTM相互作用转化为稳定的共价产物，之后炔烃手柄使得能够基于点击化学缀合荧光团用于可视化或生物素标签用于亲和富集和质谱鉴定。该策略首先使用基于二苯甲酮的光亲和探针捕获三甲基化组蛋白H3赖氨酸4（H3K4me3）的阅读器，随后开发了基于双吖丙啶的探针作为更高产率、更特异的替代方案，相对于二苯甲酮支架实现了改善的光交联效率。除阅读器鉴定外，相同的探针架构已被扩展用于捕获PTM擦除器，包括去除组蛋白赖氨酸乙酰化和丙二酰化的酶，通过捕获催化周转前形成的瞬态酶-底物相互作用。
邻近标记方法在PTM蛋白质变体相互作用背景下具有固有局限。邻近标记方法中的第一个基本设计问题是，在设计邻近标记分子时需要一定水平的结构知识。一旦做出该设计，主要挑战是实现标记酶对靶蛋白质修饰形式而非未修饰形式的特异性定位，特别是对于低化学计量比的修饰。该挑战进一步分支为假阳性问题，因为难以辨别相互作用蛋白质是否具有修饰特异性。基于抗体的靶向策略部分解决了该问题，但引入了前面章节讨论的抗体的选择性局限。此外，由于酶促邻近标记在有限暴露窗口内捕获标记半径内的所有蛋白质，无论其与目标PTM的关系如何，所得数据集必然包括来自丰富邻近蛋白质的背景信号，这些蛋白质与修饰蛋白质组无功能关联，同时也偏向于相互作用时间较长的蛋白质。仔细的实验设计包括竞争性抗体封闭对照、与未修饰位点对照的比较，以及与互补相互作用数据的整合，对于区分修饰特异性相互作用与背景生物素化至关重要。
3.5. 将目标PTMs递送到细胞蛋白质组中
一种概念上不同的PTM功能表征方法采用遗传密码扩展（GCE）或化学连接策略，在靶蛋白质内的特定位点安装确定的修饰或接近的结构模拟物。与上述发现导向的方法不同，这些方法不鉴定新型PTM位点，而是通过提供足够数量的均一修饰蛋白质变体用于结构、酶学和细胞生物学研究，使得对已知修饰进行严格的生化和细胞表征成为可能。
遗传密码扩展利用正交氨酰-tRNA合成酶（aaRS）/tRNA对的工程化，最常见的是源自产甲烷古菌的吡咯赖氨酰系统，使得能够响应通过定点诱变引入的琥珀（UAG）终止密码子而核糖体掺入非经典氨基酸（ncAAs）。GCE的化学范围已通过吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（PylRS）活性位点的理性工程化大幅扩展，一种系统方法使用结构引导诱变，对特定底物实现了高达六倍的ncAA掺入效率改进。GCE已被应用于安装PTM模拟物，包括乙酰赖氨酸、丙酰赖氨酸和各种酰化标记，并与代谢标记和化学选择性衍生化策略相结合。Huang实验室最近的一项研究通过利用化学选择性探针检测赖氨酸乙酰乙酰化，并将其通过GCE整合到蛋白质组中，同时在全蛋白质组范围分析乙酰乙酰化景观并验证位点特异性修饰的功能后果，例证了这种组合潜力。
化学连接涵盖两种主要策略。天然化学连接（NCL）利用C端硫酯与N端半胱氨酸之间的化学选择性反应，在水性条件下连接两个未保护的肽段或蛋白质片段，使得能够合成在连接区域内带有确定修饰的特定蛋白质变体。表达蛋白质连接（EPL）通过将其中一个片段制备为重组内含肽融合蛋白来扩展该方法，允许获得比单独全合成更大的修饰蛋白质。NCL用于PTM功能研究的效用已在染色质生物学的早期工作中得到证明，包括合成K16位点特异性乙酰化的组蛋白H4以研究该修饰在核小体压缩中的作用。虽然化学连接主要应用于制备修饰蛋白质用于体外生化和结构研究，近期工作已证明分裂内含肽系统可直接在细胞中介导组蛋白尾部的翻译后修饰，为细胞内化学连接作为研究细胞背景下蛋白质PTM功能的策略建立了概念验证。
酶连接为细胞内PTM安装提供了互补途径。分选酶A是一种细菌转肽酶，天然参与肽聚糖生物合成，识别C端LPXTG分选基序并形成酰基-酶硫酯中间体，随后被第二底物上的N端甘氨酸-甘氨酸亲核试剂解析，该反应长期在体外被利用作为分选酶介导的连接（SML）用于产生位点特异性修饰蛋白质。该策略通过开发分选酶介导的复分解（SMM）得到扩展，其利用相同的转肽平衡将现有C端尾部交换为合成的、带PTM的肽段，而无需底物首先被工程化以具有经典N端或C端分选序列。使用通过结构引导诱变鉴定的激活突变组合产生的工程化钙非依赖性分选酶变体（6M-Srt），将带有确定PTMs的合成组蛋白H3 N端肽段递送到活细胞中，并直接复分解到内源性染色质结合组蛋白H3上以替代其天然N端尾部。这代表了首次证明酶连接策略可在细胞中编辑染色质上的天然组蛋白PTM模式，与遗传密码扩展和蛋白质反式剪接方法形成对比，后者通常限于编辑染色质沉积前新合成的组蛋白，无法访问预先存在的、染色质掺入的组蛋白池。
GCE和化学连接均受技术约束，这些约束定义了其适当的应用领域。GCE限于使用琥珀密码子抑制策略每个开放阅读框掺入单个ncAA（三连体密码子系统的结果），并与UAG密码子处的终止竞争，降低掺入效率。该方法进一步限于可结构编码为单个氨基酸残基的修饰，排除复杂的多残基或多步修饰。通过NCL的化学连接需要在连接点处存在半胱氨酸残基；当天然序列在所需位点缺乏半胱氨酸时，必须引入非天然半胱氨酸或通过其他含硫醇残基的脱硫作用产生，这增加了合成复杂性并可能损害产物的生化性质。蛋白质中多个半胱氨酸残基的存在也可能降低连接效率和选择性。尽管有这些约束，GCE和化学连接代表了机制性PTM生物学不可替代的工具，提供了通过其他方式无法实现的确定修饰状态的访问。
值得注意的是，GCE和化学连接占据与上述分析绘制方法根本不同的方法学 niche：这些工具不是检测或量化复杂蛋白质组中天然存在的PTMs，而是按设计生成均一定义的单蛋白质变体材料。因此，支配蛋白质组尺度检测方法的完整性、质量作用和定量考虑不直接适用，相关权衡反而是位点特异性结构确定性与下述实际合成约束之间的权衡。
总之，本节讨论的方法不仅靶向化学不同，而且能够产生的数据基本类型也不同。代谢标记和化学选择性衍生化，即使与同位素或同量异序定量配对，主要支持匹配实验条件下PTM水平的相对比较，而非绝对化学计量测量，因为其信号与竞争性内源性池（代谢标记）卷积或被保持天然结构所需条件（化学选择性衍生化）所限制。可裂解富集手柄提供了最直接的途径来获得明确的位点水平定性鉴定，但同样受限于多步工作流程固有累积损失的相同处理样品间相对定量。邻近标记严格来说与PTM定量完全正交：它报告候选相互作用物的相对富集，而非修饰本身的占据率，并进一步受限于标记窗口的有限、时间积分性质。GCE和化学连接完全落在该框架之外，以蛋白质组尺度检测换取组成均一材料的生成。第二个相关主题几乎在本综述讨论的每种分析绘制方法中反复出现：每种方法从根本上受限于类似物与内源性代谢物之间、探针与脱靶亲核试剂之间、脱硫生物素化肽段与内源性生物素之间，或标记酶与其诱饵自身表达水平之间的某种质量作用竞争形式，这种竞争支配着底层化学或酶促反应可实现的完整性。
4. 化学生物学工具在蛋白质PTM研究中的成功应用
虽然代表性例子已纳入上述方法学讨论中，但一些近期研究因其技术复杂性或发现结果的生物学意义而值得专门讨论，特别是那些在单一工作流程中整合多种化学生物学策略的研究。为与第3节的组织框架保持一致，这些研究按各自采用的主要化学生物学策略分组如下。
4.1. 代谢标记的应用
单胺化，即转谷氨酰胺酶介导的生物胺与谷氨酰胺残基的偶联，已成为PTM生物学中相当活跃的领域，近期工作扩大了胺底物的目录并阐明了位点特异性修饰的功能后果（例如组蛋白单胺修饰情况下的转录控制）。在研究人员所在实验室中，部署炔烃官能化组胺探针在代谢标记工作流程中鉴定了全蛋白质组450多个候选组胺化底物。其中，组蛋白变体H2AX被鉴定为功能显著的底物。除了绘制H2AX上的修饰位点外，研究人员证明了组胺化调节γH2AX的形成，γH2AX是H2AX的磷酸化蛋白质变体，作为DNA双链断裂的分子标记，对细胞活力具有下游后果。
代谢标记还使得化学蛋白质组学分析扩展到此前无法通过该方法访问的PTM类别。开发了乙酰乙酸-炔烃探针来分析巴豆酰化，即将巴豆酰基添加到赖氨酸或半胱氨酸残基上，特别是在经历生酮作用的细胞中，这些细胞产生高于平均量的乙酰乙酸。除了鉴定新的赖氨酸巴豆酰化位点外，该研究报告了半胱氨酸巴豆酰化作为独特PTM类别的首个全蛋白质组证据。一个候选物——线粒体过氧化物还原酶PRDX3的Cys229——的功能表征表明，巴豆酰化PRDX3蛋白质变体损害该酶解毒活性氧的能力，直接将巴豆酰化化学计量与酮体代谢期间的线粒体氧化还原平衡联系起来。
PTM蛋白质组学的时间维度同样通过代谢标记得到解决，采用称为基于PTM的分泌蛋白质组分析策略，该策略将脉冲-追踪代谢标记与专门设计用于捕获在限定时间窗口内从细胞分泌的蛋白质的方案相结合。通过将衣康酸-炔烃探针与分泌蛋白质组选择性样品制备偶联，该方法使得能够追踪衣康酸化——一种源自免疫代谢物衣康酸的非酶促修饰——在蛋白质通过分泌途径转运时的变化，提供了对先前不可及的PTM-分泌蛋白质组轴的访问。
统一这些应用中的几个的主题是，代谢物模拟策略同样容易应用于非酶促修饰和酶促修饰，其中半胱氨酸由于硫醇盐侧链特别亲核而成为该非酶促类别中的主要受体残基。上述生酮衍生的巴豆酰化在单一酶上阐明了这一原理，其中PRDX3的巴豆酰化Cys229蛋白质变体损害活性氧解毒，但相同的探针逻辑已被全蛋白质组应用于几种反应性代谢物。一种衣康酸-炔烃探针（ITalk）保留了母体代谢物的α,β-不饱和羧酸并再现其抗炎活性，使得能够在活的炎性巨噬细胞中直接定量、位点特异性分析衣康酸化，在1900多种蛋白质上绘制了1100多个衣康酸化半胱氨酸位点，并进一步应用于细菌系统。类似的探针已被开发用于肿瘤代谢物富马酸，其以Michael型反应添加到半胱氨酸硫醇上，产生富马酸-炔烃类似物S-(2-琥珀酸)半胱氨酸。在未转化和富马酸水合酶突变细胞中应用时，解析了该修饰的反应性景观，并鉴定了位于关键蛋白质-蛋白质相互作用界面的SMARCC1中对琥珀酸化敏感的半胱氨酸。类似地，脂质过氧化产物4-羟基-2-壬烯醛的炔基类似物允许在完整细胞中对蛋白质烷基化进行位点特异性定量。总之，这些研究表明代谢标记不限于酶促安装的PTMs，而是相同的生物正交工作流程提供了对一类将细胞代谢状态与蛋白质功能耦合的修饰的全蛋白质组、位
