《Viruses》：Multiplex PCR-Based Targeted Sequencing for Broad-Spectrum Pathogen Surveillance in Imported Febrile Travelers at Shenzhen Ports
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目的：建立并评估一种基于多重PCR的靶向下一代测序（targeted next-generation sequencing，tNGS）方法，用于输入性传染病监测中的广谱病原体检测。方法：构建了覆盖101种与输入性传染病相关病原体的靶向测序panel，包括病毒、
目的：建立并评估一种基于多重PCR的靶向下一代测序（targeted next-generation sequencing，tNGS）方法，用于输入性传染病监测中的广谱病原体检测。方法：构建了覆盖101种与输入性传染病相关病原体的靶向测序panel，包括病毒、细菌、非典型细菌和寄生虫。通过优化引物浓度以提高扩增均一性。采用稀释系列、重复性测试、特异性panel及定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）阳性临床参考样本评估分析性能。该方法进一步应用于167份临床样本队列，包括110份临床监测样本和57份qPCR阴性发热样本。结果：引物平衡优化后，该检测方法表现出稳定的扩增均一性，所有测序反应均超过预设的92%阈值。在分析灵敏度测试中，寨卡病毒（Zika virus）和甲型流感病毒H3亚型（influenza A virus H3 subtype）均在2×102 copies/mL浓度下被检出；该检测限仅针对这两个靶标确定，并非针对整个panel建立。特异性评估显示靶标识别准确，无假阳性病原体判定。与qPCR相比，该方法在30份qPCR阳性参考样本中显示出96.7%的一致性。在临床队列中，167份样本中有115份经tNGS检测为阳性，检出率为68.9%。在57份qPCR阴性发热样本中，31例（54.4%）检出病原体，包括病毒-细菌和细菌-细菌共检出模式。循环阈值（cycle threshold，Ct）值与log10转换的测序读数呈弱负相关（Spearman rho = ?0.29，p = 0.126）。结论：基于多重PCR的tNGS检测方法显示出广谱病原体覆盖能力和稳定的扩增均一性。分析灵敏度仅使用寨卡病毒和甲型流感病毒H3亚型进行评估。该方法在检测的阳性样本中与qPCR表现出高度一致性，并能在qPCR阴性发热样本中检出混合病原体。该方法可作为病原体筛查和输入性传染病监测的有用补充工具。
输入性传染病口岸监测的新利器：基于多重PCR靶向测序的广谱病原体检测方法解读
一、研究背景与意义
随着全球人口流动和国际经贸往来的持续增加，输入性传染病的跨境传播风险显著上升。发热是输入性传染病最常见的临床表现之一，其病原谱极为复杂，涉及呼吸道病毒、肠道病毒、虫媒病毒以及多种细菌和寄生虫。尤其在海关监测场景中，输入性发热病例常表现为非特异性临床症状且潜在病原体多样，这给快速病原体鉴定和精准筛查带来了巨大挑战。因此，建立适用于输入性发热病例的高通量、多病原体检测策略，对提升口岸传染病监测预警能力具有重要意义。
目前，qPCR凭借检测时间短、灵敏度高、操作相对简便等优势，仍是输入性传染病病原体检测的主要方法之一。然而，传统qPCR检测通常针对单一或低多重靶标设计，覆盖面有限，在非典型临床表现、低病原载量或混合感染情况下容易出现漏检。在实际筛查场景中，qPCR阴性结果并不一定能排除病原体感染，尤其是在低丰度或非常见病原体感染时。因此，需要更广谱、更高通量的检测策略作为补充诊断手段。
宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）在未知病原体鉴定和复杂感染诊断方面展现出较大潜力，能够实现无预设靶标的无偏广谱病原体检测。然而，mNGS的临床应用仍受多种因素限制，包括宿主核酸背景干扰显著、测序成本高、数据量大以及生物信息学分析复杂等。相比之下，基于多重PCR富集的靶向下一代测序（targeted next-generation sequencing，tNGS）能够特异性扩增靶病原体核酸，在有效降低宿主背景干扰的同时提升低丰度病原体的检测能力。因此，tNGS在多病原体筛查和输入性传染病监测中展现出良好的应用前景。
二、研究内容概述
研究人员成功建立并评估了一种覆盖101种输入性传染病相关病原体的多重PCR靶向测序方法。该方法涵盖病毒、细菌、非典型细菌和寄生虫等与呼吸道感染、肠道感染、虫媒传染病和人畜共患病相关的病原体。通过测序引导的引物平衡优化，该方法在高度多重化条件下实现了稳定的扩增性能。在临床评估中，该方法在已知阳性样本中实现了76.36%的病原体检出率，并在54.4%的qPCR阴性发热样本中检出病原体，显示出其在口岸输入性传染病监测中的应用潜力。
三、关键技术方法
研究人员主要采用了以下几项关键技术方法：一是构建覆盖101种病原体的靶向测序panel，每种病原体选择3个靶区域，共303个靶区域及对应引物对，参考序列来自GenBank、BV-BRC等数据库；二是采用多重PCR扩增策略，设置两个独立引物池以减少引物干扰，通过两轮PCR完成靶标扩增和文库构建；三是利用MGISEQ-200RS平台进行高通量测序；四是采用fastp进行数据质控、MEGAHIT进行序列组装、BLASTn进行病原体鉴定、BWA和SAMtools进行序列比对和统计。临床样本队列来源于2021年5月至2023年8月深圳海关口岸出入境旅客，包括92份咽拭子、53份肛拭子、46份血液样本和6份疱疹液样本。
四、研究结果
4.1 多重靶向测序方法的构建与优化
研究人员构建了针对101种输入性传染病相关病原体的多重PCR靶向测序方法。在引物平衡前，使用MFEprimer对同池共扩增引物间的潜在相互作用进行了计算机模拟评估。通过6个浓度梯度（10、20、30、60、90和120 nM）优化引物浓度，其中30 nM浓度表现出最佳扩增性能，32次测序反应的平均均一性为90.3%，中位均一性为92.4%。经测序引导的引物平衡后，最终优化引物池包含333个有效panel扩增子，在53次质粒测序反应中表现出稳定的扩增均一性，中位均一性为94.9%，所有53次测序反应均超过预设的92%均一性阈值。
4.2 分析性能评估
通过系列稀释实验、重复性测试、特异性评估和qPCR阳性参考样本对分析性能进行了全面评估。在寨卡病毒和甲型流感病毒H3亚型的稀释实验中，测序读数随模板输入量下降呈浓度依赖性减少，两个靶标在2×102 copies/mL浓度下仍可检出，该浓度被定义为这两个评估靶标的分析检测限。重复性评估中，寨卡病毒扩增子水平变异系数范围为12.32%至29.68%，甲型流感病毒H3为6.32%至22.75%，总体平均CV为18.05%。特异性评估包含16种已知病原体，所有预期病原体-模板组合均产生强靶标特异性信号，包括登革病毒血清型I-IV的准确区分，无非靶标信号超过阳性阈值，无假阳性病原体判定。使用30份qPCR阳性临床参考样本进行准确性评估，29/30份样本（96.7%）检测结果一致，仅1份高Ct值（Ct 36.18）的SARS冠状病毒样本未检出测序读数。
4.3 临床样本病原体检测
该方法应用于167份样本的临床队列，总体115份样本经靶向测序阳性，检出率为68.9%。检出的病原体谱包括呼吸道病毒、肠道病毒、虫媒病原体以及细菌/寄生虫靶标。高频检出病原体包括SARS-CoV-2、甲型流感病毒H1亚型（IAV-H1）、肺炎支原体、人腺病毒B（HAdV-B）、甲型流感病毒H3亚型（IAV-H3）、呼吸道合胞病毒B亚型（RSV-B）、流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和EB病毒。值得注意的是，水痘-带状疱疹病毒（VZV）和丙型流感病毒（ICV）在发热旅客样本中被检出，表明该方法能识别常规qPCR筛查范围之外的临床相关病毒病原体。3例临床相关tNGS阳性病毒检出经PCR进一步验证，包括VZV（30,625条测序读数，PCR Ct值30.33）、登革病毒/DENV-2（372和462条读数，PCR Ct值34.7）和ICV（74,097条测序读数，PCR Ct值28.0）。
4.4 混合感染分析
在167份样本的临床tNGS队列中，18份样本检出超过一种病原体，混合检出率为10.8%。观察到的共检出模式包括病毒-病毒、病毒-细菌和细菌-细菌组合。共识别出22个成对共检出事件，代表18个独特病原体对。反复出现的共检出组合包括鲍曼不动杆菌与流感嗜血杆菌（n=2）、EB病毒与流感嗜血杆菌（n=2）、EB病毒与金黄色葡萄球菌（n=2）以及IAV-H1与IAV-H3（n=2）。其他混合检出模式涉及呼吸道病毒、肠道病毒和细菌病原体的组合，如CMV与RSV-B、HMPV与HAdV、诺如病毒GI与轮状病毒、RSV与SARS-CoV-2、HAdV-B与大肠杆菌、肺炎支原体与鼻病毒等。
4.5 qPCR Ct值与测序读数的相关性
在29份qPCR阳性/tNGS阳性配对样本中，Spearman相关分析显示Ct值与测序读数丰度之间存在弱负相关（Spearman rho = ?0.29，p = 0.126）。线性拟合分析显示Ct值与log10转换测序读数之间存在负回归趋势（y = ?0.033x + 6.32），表明测序读数丰度并非仅由qPCR估算的病原载量决定，还可能受引物效率、多重竞争、病原体基因组变异和样本质量等因素影响。
五、讨论与结论
研究表明，基于多重PCR的靶向测序方法在口岸输入性传染病监测中具有良好应用前景。与常规qPCR相比，该方法提供更广的病原体覆盖范围，可在单一工作流程中同时检测呼吸道、肠道、虫媒和人畜共患病原体。在qPCR阴性发热样本中检出54.4%的病原体，提示靶向测序可为临床未确诊病例提供额外病因学信息。混合病原体共检出模式的识别也是重要发现，这些模式难以用传统单靶标qPCR全面表征。
该研究存在一定局限性，包括样本量相对有限、未进行平行mNGS对比、重复性评估仅在单一浓度下进行、特异性评估覆盖面有限、未纳入内部扩增对照、无法检测panel外病原体等。此外，303对引物未独立评估扩增效率和特异性，靶位点、参考序列登录号和引物序列属于商业检测产品的专有信息，限制了对该方法的独立评估和复现。
综上所述，研究人员成功建立并验证了一种覆盖101种输入性传染病相关病原体的多重PCR靶向测序方法。经测序引导的引物平衡后，该方法实现稳定扩增性能，所有测序反应的扩增均一性超过92%。分析灵敏度以寨卡病毒和甲型流感病毒H3亚型为代表靶标评估，两者均在2×102 copies/mL浓度下检出。由于未对所有病原体单独确定分析检测限，该灵敏度不应推广至整个panel。临床评估中，该方法在已知阳性样本中实现76.36%的病原体检出率，并在54.4%（31/57）的qPCR阴性发热样本中检出病原体，包括涉及病毒-细菌和细菌-细菌组合的混合病原体共检出事件。腺病毒和流感嗜血杆菌是qPCR阴性发热样本中最常检出的病原体之一，提示发热旅客的病因学特征复杂多样。这些发现证明了多重靶向测序在口岸输入性传染病监测中用于广谱病原体筛查、混合感染检测和病因学调查的潜在价值。
