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人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）在中枢神经系统（CNS）中的持续存在，仍然是实现治愈的主要障碍，也是HIV相关神经认知障碍（HAND）的关键驱动因素。数十年来，由于缺乏能够重现人类大脑复杂性的实验模型，HIV-1神经病理机制的研究进展一直受到限制。基于人类诱
人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）在中枢神经系统（CNS）中的持续存在，仍然是实现治愈的主要障碍，也是HIV相关神经认知障碍（HAND）的关键驱动因素。数十年来，由于缺乏能够重现人类大脑复杂性的实验模型，HIV-1神经病理机制的研究进展一直受到限制。基于人类诱导多能干细胞（iPSCs）来源的三维（3D）大脑类器官的发展，通过提供生理相关且临床可转化的平台用于研究CNS中的HIV-1感染，显著推动了该领域的发展。本综述总结了大脑类器官技术的演变历程，从自组织培养到免疫活性类器官及多区域组装体（assembloids）。研究人员重点阐述了这些模型在理解HIV-1神经炎症、神经元损伤及CNS储存库建立方面的贡献。此外，研究人员还讨论了将类器官与生物工程及单细胞组学方法相结合的新兴进展，以克服当前局限性，并加速针对CNS中HIV-1持续存在的治疗及治愈策略的开发。
主体内容总结
2. 大脑类器官的技术演变
大脑类器官的发展经历了从二维（2D）培养向三维（3D）系统的转变，后者利用了多能干细胞固有的自组织能力。早期研究表明，悬浮培养的胚胎干细胞可自发产生极性神经组织。2008年，Eiraku等人证明小鼠胚胎干细胞可形成类似早期皮质发生的皮质样结构。2013年，Lancaster等人利用人类多能干细胞（hPSCs）生成了包含多个脑区（包括大脑皮质、腹侧前脑和海马）的脑类器官。同期，Kadoshima等人证实了皮质组织的形成，其重现了胎儿大脑发育的关键特征，包括分层组织和人类特异性外层放射状胶质细胞。人类大脑类器官的一大优势在于其保留供体特异性遗传背景，从而实现患者来源的疾病建模。然而，早期类器官缺乏血管系统、基质成分和组织驻留免疫细胞（尤其是小胶质细胞），这对神经HIV研究尤为重要。为弥补这一不足，研究者开发了多种生成含小胶质细胞脑类器官（MCOs）的策略。
2.1 类器官内小胶质细胞的内源性生成
一种方法是从共同祖细胞群体同时生成神经外胚层和中胚层谱系。Ormel等人证明了自发出现的小胶质样细胞在转录组和功能上均与成体小胶质细胞高度相似。此后发展了多种替代方案，包括Cakir等人的转录因子引导分化方法以及Bodnar等人报告的简化方法。由于小胶质细胞与神经细胞同步发育，这些模型实现了高度的发育整合。然而，非引导分化可能导致类器官间的变异性，因此需要对干细胞系、培养条件和细胞外基质进行严格的质量控制。合成水凝胶可能通过提供更标准化的培养环境来改善可重复性。
2.2 小胶质细胞的外源掺入与空间整合
另一种策略是将成熟小胶质细胞引入预先形成的类器官中。Abud等人证明iPSC来源的小胶质细胞能够成功整合到神经组织中，获得分枝状形态，并表现出天然小胶质细胞特有的吞噬和炎症功能。这些细胞还可进行基因工程改造以模拟疾病特异性机制。重要的是，Dos Reis等人首次利用该平台研究HIV-1感染，表明掺入的小胶质细胞支持持续低水平病毒复制并产生促炎细胞因子（如TNF-α和IL-1β），与体内神经HIV病理高度相似。与外源性生成的小胶质细胞不同，外源引入的小胶质细胞通常从周围培养基进入成熟类器官，最初定位于外层皮质样结构，随后逐渐向内迁移。因此其分布常呈异质性，可能偏向类器官外周。尽管存在这些局限，外源掺入仍是生成免疫活性大脑类器官的实用且高度可重复的策略。
2.3 与造血祖细胞共培养
另一种策略是引入造血祖细胞（HPCs）而非成熟小胶质细胞。在该系统中，HPCs被引入发育中的类器官，在细胞因子（包括IL-3、IL-34、M-CSF和GM-CSF）刺激下迁移并分化为小胶质细胞。该方法更接近小胶质细胞对CNS的发育性定植，并允许控制类器官内小胶质细胞的丰度。Song等人通过共培养实现了小胶质细胞向背侧前脑类器官的高效掺入。W?rsd?rfer等人通过将中胚层祖细胞与神经类器官结合并经PDGF或VEGF处理，生成了血管化类器官，实现了小胶质细胞浸润。Narasipura等人开发了将造血祖细胞整合到新生类器官中的共培养系统，以生理相关水平（约7%）生成了具有分子和功能特征类似于驻留人类小胶质细胞的脑类器官来源小胶质细胞（CO-iMg）。然而，大多数方案仅实现部分小胶质细胞整合，长期存活仍具挑战。
2.4 血管化含小胶质细胞脑类器官
传统脑类器官缺乏血管化，限制了氧气和营养物质的扩散及长期成熟。为克服这一挑战，研究者通过在类器官发育过程中掺入血脑屏障（BBB）内皮细胞、中胚层祖细胞或血管生成信号通路，开发了血管化脑类器官。这些进展促成了血管化含小胶质细胞脑类器官（vMCOs）的出现，其可同时模拟神经血管和神经免疫相互作用。通过支持神经细胞、小胶质细胞和血管样结构的共同发育，vMCOs表现出改善的活力、增强的细胞成熟度和更生理相关的炎症反应。内皮细胞通过直接细胞相互作用及分泌营养和信号因子，促进神经元成熟和小胶质细胞功能发育。鉴于HIV-1通过神经血管界面进入CNS并在脑驻留髓系细胞中建立储存库，vMCOs为研究病毒穿越BBB、小胶质细胞感染及HIV相关神经血管功能障碍提供了有前景的平台。
2.5 从类器官到组装体
区域特异性类器官（代表皮质、中脑、丘脑、小脑和纹状体）的发展扩展了体外模拟人类大脑发育的能力。然而，许多神经过程依赖于多个脑区之间的相互作用。为弥补这一局限，研究者将不同类器官融合以创建组装体（assembloids），其可模拟脑发育过程中的区域间通讯和神经元迁移。这些系统已成功重现了中间神经元切向迁移和皮质-纹状体连接等过程。尽管组装体提供了更生理相关的神经回路模型，但其在病毒神经病理发生中的应用仍 largely 未被探索。将小胶质细胞纳入组装体系统可能为研究病毒复制、神经炎症和区域特异性CNS病理提供强大平台。
2.6 芯片上类器官
传统类器官缺乏血管化和生理性液体流动。芯片上类器官通过将类器官与微流控装置或3D打印支架整合来弥补这些不足，提供持续灌注、营养递送和废物清除，从而更好地模拟体内组织环境。这些平台已实现小胶质细胞募集和神经免疫相互作用的研究，并支持高通量药物筛选和实时监测。尽管前景广阔，芯片上类器官仍技术复杂且成本高昂，标准化方案尚缺乏。此外，先进神经类器官和嵌合模型的伦理问题可能对更广泛采用和临床转化构成挑战。伦理考量还涉及患者来源和供体特异性遗传背景——如CCR5Δ32纯合或杂合突变，其直接决定细胞对R5嗜性HIV-1株的易感性，因此需要透明的供体知情同意框架。此外，当前脑类器官模型缺乏完整重建的适应性免疫系统（如浸润性细胞毒性T淋巴细胞和血管周围适应性监视），这对其完全重现适应性免疫介导的控制、免疫逃逸及CNS病毒储存库内的长期动态平衡能力构成固有边界。
3. 在脑类器官中模拟HIV-1感染与神经炎症
MCOs或CO-iMg已成为研究人类CNS中HIV-1感染的强大模型。研究表明，MCOs表达关键HIV-1进入因子CD4、CCR5和CXCR4，并支持生产性感染，表现为病毒蛋白表达、病毒RNA产生和前病毒DNA整合。这些体外观察与临床发现一致，即小胶质细胞是HIV-1的主要CNS靶点和储存库。评估CNS储存库需要区分生产性感染、持续低水平感染和深度转录潜伏。虽然类器官模型成功支持急性和持续复制，但在抑制性抗逆转录病毒治疗（cART）下模拟长期病毒储存库仍具挑战。在静态体外培养中，长期cART给药常在建立稳定非复制潜伏储存库所需的数周时间尺度上引起化合物毒性或培养基耗竭伪影。未来利用微流控灌注（芯片上器官）进行优化对于在长期抑制性药物方案中维持组织活力至关重要。
除模拟HIV-1感染外，MCOs已成功用于研究神经炎症和HAND的机制。HIV感染的小胶质细胞引发强烈的炎症反应，并扩展至未感染的旁观细胞。单细胞RNA测序研究揭示了神经祖细胞和成熟神经元中的广泛转录变化，包括神经递质转运蛋白表达减少以及衰老和凋亡相关基因表达增加。HIV诱导的神经炎症导致突触丢失、树突棘变性和神经元凋亡，这些是HAND的关键病理特征。这些模型还证明了在CNS相关背景下评估cART疗效的价值。cART有效抑制病毒复制并部分恢复HIV感染类器官中的神经元功能，凸显了脑类器官模型在评估抗逆转录病毒疗法和识别新型神经HIV干预措施中的实用性。
重要的是，免疫活性脑类器官为研究CNS储存库中HIV-1的持续存在提供了独特平台。小胶质细胞模型研究表明，其潜伏调控与外周CD4+ T细胞和单核细胞不同。例如，Toll样受体3（TLR3）激活可选择性触发小胶质细胞中整合HIV前病毒从潜伏状态再激活。除模拟病毒持续存在外，近期研究揭示含小胶质细胞脑类器官具有内在抗病毒防御机制。Xiao等人证明TLR3激活诱导I型和III型干扰素的强效表达，显著抑制了持续的HIV-1生产性复制，表明类器官内的神经和免疫细胞可启动有效的抗病毒防御。这些发现共同确立了免疫活性脑类器官作为研究CNS中HIV-1感染、病毒持续存在和宿主抗病毒免疫的多功能平台，同时促进新型治疗和治愈导向策略的开发。
4. 脑类器官模型的一致性与可重复性
将脑类器官应用于神经HIV研究的主要挑战是确保实验一致性和可重复性。诱导多能干细胞（iPSC）供体遗传背景、细胞系质量、分化效率、培养条件、细胞外基质和批次间差异均可导致相当大的变异性。这些因素影响类器官大小、细胞组成、成熟状态和HIV-1感染易感性，从而使研究间比较复杂化。近期进展通过标准化分化方案、质量控制标准、自动化生物反应器系统和化学成分明确的培养基显著改善了可重复性。同基因iPSC系的使用、多个生物学重复以及严格的分子表征（包括单细胞转录组学和免疫表型分析）进一步增强了实验可靠性。均匀聚集体组装方法实现了小胶质细胞免疫组分受控且高度可重复的掺入。此外，神经类器官或早期神经外胚层的冷冻保存已成为减少批次变异和改善跨实验室实验一致性的实用策略。为减轻批次间变异并建立严格的实验标准化，实验室应实施系统性质量控制指标：小胶质细胞丰度和成熟度（通过流式细胞术或单细胞转录组学量化，确保免疫细胞比例一致，如稳态标志物IBA1、TMEM119和P2RY12的目标范围为5%至10%）；形态计量和结构标准化（感染前监测类器官直径、球形均匀性和脑室/皮质层组织）；感染效率和病毒输入（在匹配的生物学重复中标准化感染复数（MOI）、病毒滴度和精确的细胞相关或细胞游离接种条件）；标准化采样动力学（协调纵向采样时间点，如感染后3-7天的急性期与14-28天以上的持续/潜伏期，并利用同基因iPSC对照以考虑共受体表达（CCR5/CXCR4）的供体特异性遗传变异）。
5. 类器官工程和基因组学的未来方向
尽管进展迅速，当前脑类器官模型仍缺乏CNS的若干关键特征，包括功能性血管系统、完整免疫细胞群体和稳健的髓鞘形成。其他挑战包括批次间变异性、成熟度局限于胎儿发育阶段以及模拟慢性神经退行性过程的困难。当前脑类器官的一个主要局限是缺乏生理性灌注，这限制了营养递送和废物清除，导致缺氧和坏死核心形成。类器官切片和微流控芯片上器官平台等策略通过增强氧合和营养交换改善了组织活力并促进成熟。类器官与微流控系统的整合也可能促进更生理相关的BBB模型，为研究HIV-1向CNS的运输以及评估治疗药物的渗透性和功效创造新机会。尽管小胶质细胞的掺入显著提高了脑类器官在神经HIV研究中的实用性，但其他重要免疫细胞群体（包括T细胞、血管周围巨噬细胞和浸润单核细胞）仍 largely 缺失。未来模型系统可能结合组装体技术、芯片上器官工程和干细胞生物学的进展，以生成更全面的神经免疫平台。随着类器官模型日益复杂，高分辨率分析方法对于评估细胞组成、发育保真度和疾病相关改变至关重要。单细胞转录组学、表观基因组学以及人类细胞图谱等大规模参考资源为基准测试类器官保真度、表征细胞异质性和识别HIV相关神经病理发生中的分子通路提供了强大框架。
6. 结论
人类iPSC来源的脑类器官已成为研究神经HIV的生理相关平台，显著推进了对CNS中HIV-1感染、神经炎症和神经元损伤的理解。多种类器官模型已被开发，每种均具有独特优势和局限。因此，没有单一模型适用于所有应用，研究人员在选择适当系统时必须仔细权衡生物学复杂性、可重复性、可扩展性和实验可操作性。生物工程领域的持续进展，包括血管化类器官、芯片上器官技术和日益复杂的神经免疫共培养系统的开发，预计将进一步提高这些模型的生理相关性。与此同时，高分辨率单细胞和空间基因组学方法将提供对细胞异质性、宿主-病毒相互作用和疾病相关分子通路的前所未有的见解。这些创新将共同提高模型保真度和分析能力，从而更准确地研究HIV神经病理发生和CNS病毒持续存在。最终，脑类器官技术的持续改进将加速阐明HAND机制的努力，并促进旨在消除CNS中HIV-1储存库的治疗策略的开发。
