《Journal of Oral Microbiology》：Why does apical periodontitis persist? A shotgun metagenomic survey of the microbial community in primary and persistent periapical granulomas
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目的：本横断面观察性研究采用鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing）技术，比较原发性和持续性根尖周炎根尖周肉芽肿的微生物组，旨在识别与持续性病变相关的微生物分类群和功能通路。
方法：研究纳入17例未经治疗的根尖周炎患者
目的：本横断面观察性研究采用鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing）技术，比较原发性和持续性根尖周炎根尖周肉芽肿的微生物组，旨在识别与持续性病变相关的微生物分类群和功能通路。
方法：研究纳入17例未经治疗的根尖周炎患者（UA）、19例持续性根尖周炎患者（PA）及19例健康牙龈参考样本（HC）。在拔牙过程中采集根尖周肉芽肿及健康牙龈组织样本，进行全宏基因组鸟枪法测序。采用Shannon和Chao1指数评估α多样性；基于Bray-Curtis距离的PERMANOVA评估β多样性。采用Mann-Whitney U检验及Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）校正，比较UA与PA组间物种及预测功能通路的差异丰度；采用Spearman相关分析检验临床关联。HC组作为描述性参考。
结果：α多样性分析显示物种丰富度（Chao1，p<0.05）存在显著差异，但总体多样性（Shannon，p>0.05）无显著差异。β多样性分析显示分离趋势但未达统计学显著水平（PERMANOVA，R2=0.05085，p=0.051）。宏基因组测序揭示了UA与PA之间物种组成和功能潜力的差异。分类学分析在UA中鉴定出503种物种，而PA中仅255种。在物种水平上，多个分类群在UA与PA之间显示名义差异（p<0.05），但经FDR校正后均无统计学显著性（q>0.05）。在功能层面，多个KEGG通路在UA与PA之间显示名义差异（p<0.05，q>0.05），其中排名前三的通路相对丰度均低于3%。肿胀持续时间与多个分类群和通路呈负相关（p<0.05），而病变直径与微生物丰度关联甚微。
结论：与原发感染相比，持续性根尖周炎肉芽肿表现出较低的物种丰富度和丰度，但预测功能能力相似。需要进一步的纵向和多组学研究来探讨这些关联。
论文解读文章
一、研究背景与意义
根尖周炎（apical periodontitis，AP）是由根管系统内微生物感染引起的炎症性疾病，据估计影响全球高达52%的人口，其中约50%的根尖周病变被归类为根尖周肉芽肿。根管治疗（root canal treatment，RCT）旨在通过清除坏死牙髓组织和消毒根管系统来消除感染。RCT能显著改变根管微生物组，但对其根外生物膜的影响可能有限。残留细菌可能与持续性感染相关，被认为在慢性炎症过程中起促进作用，可能导致治疗失败和骨丧失。尽管牙髓治疗技术不断进步，但哪些在RCT后存活的特定细菌物种与持续性炎症和根尖周骨破坏相关，目前仍不清楚。因此，了解根尖区根管微生物群的组成和多样性对于制定有效的治疗策略至关重要。
既往研究面临两大主要局限：其一，超过460种细菌分类群与感染根管相关，但传统培养方法无法培养约50%的口腔细菌物种，严重限制了病原微生物的检测；其二，既往16S rRNA扩增子测序研究虽能比较原发性和持续性根尖周炎的细菌群落组成，但该方法在物种水平上分辨率有限，且无法提供微生物群落功能潜力的信息，因为其依赖系统发育标记而非全基因组内容。这些限制阻碍了研究人员识别特定致病物种并理解其对疾病持续性的预测代谢贡献。
鸟枪法宏基因组测序直接解决了上述局限，可实现物种水平的分类学鉴定，并通过KEGG通路分析同步表征预测功能基因潜力。该方法在探索微生物群落与口腔疾病关系方面发挥着关键作用，为识别与疾病持续性相关的候选生物标志物和功能特征提供了更全面的基础。因此，本研究采用横断面观察性设计，运用鸟枪法宏基因组测序比较原发性和持续性根尖周炎根尖周肉芽肿的微生物分类学和预测功能谱，旨在识别与持续性病变相关的微生物分类群和功能通路，并探索临床参数的潜在相关性。
二、研究设计与方法
本研究经复旦大学附属中山医院伦理委员会批准（方案编号：B2025-023），并在中国临床试验注册中心注册（ChiCTR2500107795）。样本量依据Kelly等提出的基于模拟的微生物组PERMANOVA框架计算，设定效应量ω2=0.05、统计功效0.8、显著性水平α=0.05，每组最低需15例，另加20%以应对样本损耗，最终纳入HC组19例、UA组17例、PA组19例。研究于2025年1月至12月在复旦大学附属中山医院口腔科开展，纳入55例拟拔牙患者。UA组为未经治疗的原发根尖周炎患牙，PA组为接受技术合格RCT至少12个月后仍存在持续性根尖周透射影和/或临床症状的患牙，HC组为因正畸原因拔除无症状阻生第三磨牙时的健康牙龈组织。所有疾病组样本均以相同方案从拔除牙齿中获取，以确保方法一致性。
研究采用的主要技术方法包括：鸟枪法宏基因组测序（Illumina NovaSeq X Plus平台）、生物信息学分析流程（fastp质控过滤、BWA比对去除人类基因组序列、MEGAHIT组装、Prodigal基因预测、CD-HIT构建非冗余基因目录、DIAMOND比对NCBI NR数据库进行物种和KEGG功能注释）、α多样性（Chao1和Shannon指数）与β多样性（Bray-Curtis距离PERMANOVA）分析、Mann-Whitney U检验及Benjamini-Hochberg FDR校正的差异丰度分析、LEfSe判别分析、Spearman相关分析，以及针对选定物种的定量PCR（qPCR）验证。
三、研究结果
微生物群落的表征
宏基因组测序成功完成了三组所有样本。α多样性分析显示，UA与PA之间的物种丰富度（Chao1指数）存在显著差异（p=0.04762），而总体多样性（Shannon指数）无统计学显著性（p=0.5058）。PCoA显示两组之间存在分离趋势，PERMANOVA确认该分离未达统计学显著性（R2=0.05085，p=0.051），PERMDISP检验显示组间多元离散度相当（p=0.10）。
物种组成
数据去冗余后，宏基因组数据集共获得38个门、67个纲、104个目、173个科、332个属和759个物种。HC组含34个门、562个物种；UA组含20个门、503个物种；PA组仅含15个门、255个物种。物种水平上，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）是三组中最丰富的物种。HC组随后为变形链球菌（Streptococcus mutans）和齿放线菌（Actinomyces dentalis）；UA组为齿放线菌和福赛坦纳菌（Tannerella forsythia）；PA组为齿放线菌和痤疮皮肤杆菌（Cutibacterium acnes）。维恩图分析显示，三组共有197个物种；HC组独有物种最多（225个），UA组次之（158个），PA组仅12个独有物种。
分类学差异
Mann-Whitney U检验鉴定出UA与PA之间4个物种丰度存在显著差异：中间普雷沃菌（Prevotella intermedia，p=0.017）、产线菌属（Filifactor alocis，p=0.022）、普雷沃菌属未定种（Prevotella sp.，p=0.023）和节齿真杆菌（[Eubacterium] nodatum，p=0.021）在UA组中丰度较高。值得注意的是，痤疮皮肤杆菌在PA组中丰度较高，但与UA相比差异未达统计学显著性（p=0.081）。然而，经Benjamini-Hochberg FDR校正后，所有物种均无统计学显著性（q>0.05）。
探索性LEfSe分析共鉴定出83个分类群显示名义差异（p<0.05），其中26个具有强判别潜力（LDA>3.0）。描述性结果显示，HC组以变形链球菌和放线菌属为特征；UA组以中间普雷沃菌和产线菌属为特征；PA组以痤疮皮肤杆菌和马氏棒状杆菌（Corynebacterium matruchotii）为特征。qPCR验证结果显示，变形链球菌和痤疮皮肤杆菌的检测结果与测序数据一致。
基因功能预测
KEGG功能注释显示，三组中最丰富的通路均为“代谢通路”（ko01100）、“次级代谢产物生物合成”（ko01110）和“多样环境中的微生物代谢”（ko01120），表明核心代谢功能构成微生物组的主要功能谱。Mann-Whitney U检验鉴定出UA与PA之间差异丰富的KEGG通路，排名前三的功能类别为“氨基酸生物合成”（ko01230）、“糖酵解/糖异生”（ko00010）和“RNA降解”（ko03018），其次为“甲烷代谢”（ko00680）。所有这些通路在PA组中的丰度均低于UA组，相对丰度均低于3%，但经FDR校正后均无统计学显著性（q>0.05）。
物种和功能贡献分析显示，物种水平上贡献排名前五的依次为牙龈卟啉单胞菌、齿放线菌、衣氏放线菌（Actinomyces israelii）、福赛坦纳菌和放线菌属口腔分类群414。功能水平上贡献前三的KEGG通路为“代谢通路”、“次级代谢产物生物合成”和“多样环境中的微生物代谢”。
临床参数与微生物特征的关联
Spearman相关分析显示，肿胀持续时间与龈沟卟啉单胞菌（Porphyromonas gulae，ρ=?0.440，p=0.0072）、节齿真杆菌（ρ=?0.507，p=0.0016）和坦纳拟普雷沃菌（Alloprevotella tannerae，ρ=?0.507，p=0.0016）呈中度负相关。病变直径仅与微小副球菌（Parvimonas micra）的相对丰度呈弱正相关（ρ=?0.376，p=0.0239）。在功能层面，肿胀持续时间与多个KEGG通路的丰度呈弱但显著的负相关（均p<0.05），涵盖核心碳代谢、核苷酸代谢、生物合成通路以及信息处理/其他通路。
四、讨论与结论
讨论部分总结：持续性根尖周炎一直是临床牙医面临的难题，现有证据表明根管系统内外的持续性感染是疾病持续的主要因素之一。本研究发现持续性病变表现出较低的物种丰富度和微生物丰度，但预测功能能力相似。PA组观察到的物种数远少于UA组（255对503种），与既往研究一致，表明持续性根尖周炎虽为多微生物感染，但所含物种远少于原发感染。较低的物种丰富度是否反映治疗相关的分类群消除或其他因素，无法从当前横断面数据中确定。
物种水平上，中间普雷沃菌在PA组中相对丰度较低，该菌为革兰阴性专性厌氧菌，与症状性根尖周炎和急性牙髓感染密切相关。痤疮皮肤杆菌（原称痤疮丙酸杆菌）在PA组中丰度较高但未达统计学显著性，该菌是常见的实验室污染物，也可能与RCT术中引入有关，并因其已知的环境应激和抗菌剂耐受性而在根管系统中持续存在。放线菌属在无显著组间差异的前20个分类群中相对丰度较高，可能提示其对标准消毒方案具有潜在抵抗力，该菌属因能在根尖周组织中持续存在而常被认定为牙髓治疗失败的原因。
功能层面，尽管PA组分类学多样性和丰度低于UA组，但总体功能基因组成保持相对稳定，这一现象可用微生物组研究中引入的功能冗余概念解释——尽管个体间分类学多样性存在差异，功能谱仍可保持显著保守。但需注意，这些发现基于基因组预测而非代谢活性的直接测量，应谨慎解读。
结论翻译：鸟枪法宏基因组分析显示，与原发感染相比，持续性根尖周炎肉芽肿表现出较低的物种丰富度和微生物丰度，但预测功能能力相似。这些发现属于探索性和假设生成性质。未来需要纵向队列研究以及多组学方法，以进一步探讨微生物特征与疾病持续性之间的关联。
