《Agronomy》：Dissecting the Evolutionary Forces Behind Codon Usage Bias in Brassica: A Chloroplast Genome Perspective from Non-Heading Chinese Cabbage
编辑推荐：
物种水平以下的叶绿体基因组变异在芸苔属（Brassica）中仍未得到充分表征，因为以往大多数研究仅依赖一个或少数代表性质体（plastome）。为确定亚种内密集采样是否能揭示被更广泛比较所掩盖的局部变异，研究人员对10个形态多样的非结球白菜（NHCC; Bra
物种水平以下的叶绿体基因组变异在芸苔属（Brassica）中仍未得到充分表征，因为以往大多数研究仅依赖一个或少数代表性质体（plastome）。为确定亚种内密集采样是否能揭示被更广泛比较所掩盖的局部变异，研究人员对10个形态多样的非结球白菜（NHCC; Brassica campestris [syn. Brassica rapa] ssp. chinensis）品种进行了完整的叶绿体基因组测序和组装，并将其密码子使用模式置于15个芸苔属叶绿体基因组的背景下进行比较。NHCC叶绿体基因组在基因组大小（153,480–153,533 bp）、GC含量（36.36–36.39%）、基因含量、基因顺序和四分区结构方面高度保守。然而，位点水平比较表明，有限的序列变异集中在少数区域。六个蛋白质编码位点和四个基因间隔区表现出相对较高的核苷酸多样性，可变位点和内部插入缺失（indel）块的明确计数进一步表征了这些数值背后的序列差异。这些位点代表用于群体水平验证和潜在分子标记开发的候选区域，而非已确认的品种特异性标记。在更广泛的比较中，15个叶绿体基因组的平均ENC（有效密码子数）仅从45.15变化到45.49，表明高度保守的密码子使用背景，以普遍偏好A/U结尾的同义密码子为特征。八个密码子——ACU、AGA、CAA、CUA、GCU、GGU、GUA和UGU——被一致地恢复为推定最优密码子，尽管ACU和GGU的统计学支持仅限于部分材料。PR2分析揭示了互补核苷酸对内的不平衡，而非对G/C结尾密码子的总体偏好。因此，本研究的主要贡献是通过对NHCC的密集采样实现质体变异的精细定位，为随后在独立采样个体中进行多样性评估和标记验证提供候选区域。
甘蓝属（Brassica）包括多种重要的蔬菜和油料作物，其叶绿体基因组通常具有高度保守的结构。然而，物种水平以下的叶绿体基因组变异在很大程度上尚未被充分表征，因为以往多数研究仅基于一个或少数代表性质体（plastome），难以发现亚种内或品种间的局部变异。非结球白菜（Non-heading Chinese cabbage, NHCC；Brassica campestris [syn. Brassica rapa] ssp. chinensis）包含多个形态类型，其叶绿体基因组是否在密集采样下仍保持保守，以及是否存在可用的变异区域，尚不清楚。为此，研究人员对10个形态多样的NHCC品种进行了叶绿体基因组测序和组装，并将其与5个公开的甘蓝属叶绿体基因组（共15个）进行比较，以定位精细变异并分析密码子使用偏倚（codon usage bias, CUB）的进化特征。
研究人员通过测序组装获得了10个完整的NHCC叶绿体基因组，大小在153,480–153,533 bp之间，GC含量为36.36%–36.39%，结构高度保守。通过与15个Brassica质体比较，发现密码子使用背景高度一致，呈现弱至中度的偏倚，并普遍偏好A/U结尾的同义密码子。重要的是，通过密集采样，发现序列变异集中在少数编码区和基因间隔区，这些区域可作为候选标记。该研究的主要意义在于提供了NHCC亚种内质体变异的精细图谱，为后续群体遗传学和分子标记开发奠定了基础。
关键方法方面：样本采自南京农业大学白马研究基地，涵盖10个NHCC品种。提取DNA后，利用Illumina NovaSeq 6000平台进行双端测序；采用GetOrganelle组装叶绿体基因组，使用GeSeq和PGA进行注释；通过REPuter和MISA-web分别鉴定长重复和简单序列重复（SSR）；利用MAFFT进行比对，DnaSP计算核苷酸多样性（Pi），自定义Python脚本统计可变位点和内部插入缺失（indel）块；使用CodonW和CUSP计算密码子使用指标，并进行ENC-GC3、PR2、中性分析等。此外，从GenBank获取5个公开Brassica叶绿体基因组用于比较。
研究结果按照论文小标题分述如下：
3.1 叶绿体基因组结构及特征：研究人员组装得到10个NHCC叶绿体基因组，其大小、GC含量、基因含量和四分区结构高度一致，仅存在53 bp的长度差异，表明基因组结构强保守。
3.2 SSRs和长重复序列鉴定：共检测到898个简单序列重复（SSR），每基因组87–91个；A/T单核苷酸重复占优势；LCX-026含有唯一的五核苷酸SSR，且长重复总数最少，缺乏互补型重复，成为重复谱离群值。
3.3 IR扩张和收缩：LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa、IRa/LSC边界在10个质体中完全一致，trnH-GUG与IRa/LSC边界距离恒为3 bp，表明IR边界高度稳定。
3.4 结构比较和分歧热点鉴定：全基因组比对未发现重排或倒位。位点水平分析显示，6个蛋白质编码基因（petA、rps4、ndhI、psaC、rps15、ycf1）的Pi高于0.0003，但仅含1–6个可变位点；4个基因间隔区（trnH-GUG–psbA、psaJ–rpl33、rpl32–trnL-UAG、rps4–trnT-UGU）Pi超过0.003。accD虽在mVISTA中有信号，但实为1个6 bp indel所致，无核苷酸替换。
3.5 不同密码子位置的核苷酸组成：在15个质体中，T3s和A3s显著高于G3s和C3s，GC3仅为26.80%–27.12%，支持A/U富集背景；GC1>GC2>GC3。
3.6 密码子使用指标分析和差异检验：平均ENC介于45.15–45.49，92.70%的基因ENC≥35，显示弱至中度CUB。RSCU分析中29个高频密码子中有28个以A/U结尾，进一步证实A/U偏好。
3.7 最优密码子分析：通过比较高、低ENC基因集，每个质体识别出15–19个推定最优密码子，其中8个（ACU、AGA、CAA、CUA、GCU、GGU、GUA、UGU）在15个质体中共有，均以A/U结尾；但仅ACU和GGU在6个材料中通过校正统计检验。
3.8 影响密码子使用偏倚的因素分析：ENC-GC3图中基因偏离期望曲线；ENC比值集中在零附近；PR2图显示T>A和G>C不对称；中性回归R2极低（0.033–0.041）。这些结果提示GC3不能单独解释CUB，但无法量化自然选择的作用。
讨论部分指出，密集采样揭示的变异主要位于非编码区和少数编码基因，这些区域是候选变异位点，但需要在独立群体中验证。accD的差异是长度多态而非替换，ycf1的变异则包含替换，但两者均未证实有功能后果。密码子使用高度保守，A/U偏好是芸苔属质体的普遍特征，而非NHCC特有。基于组成的诊断分析仅提供有限证据表明除了GC3之外还有其他因素的影响，不能作为自然选择的直接证据。结论翻译如下：10个NHCC叶绿体基因组高度保守，变异集中于6个编码区和4个基因间隔区候选区域；accD差异由6 bp插入/缺失而不是核苷酸替换引起；在15个Brassica质体中，密码子使用偏倚弱至中度，并一致偏好A/U结尾密码子，共有8个推定最优密码子。基于组成的分析表明，仅GC3不能解释所有密码子变异，但无法量化自然选择。密集的NHCC采样因此定位了精细质体变异，并为多样性分析和标记开发提供了候选区域，但仍需在独立采样的个体中进行验证。
