miR-10955-5p靶向ITPKB调控福美双诱导胫骨软骨发育不良软骨细胞增殖与分化

《Life》：miR-10955-5p Targets ITPKB to Regulate Proliferation and Differentiation in Thiram-Induced Tibial Dyschondroplasia Chondrocytes

　　

胫骨软骨发育不良（TD）是快速生长型肉鸡中常见的骨骼疾病，损害腿部健康和生产效率。然而，TD背后的转录后调控机制仍知之甚少。基于前期测序数据显示miR-10955-5p在TD软骨中表达下调，本研究通过体外功能实验探讨了其在TD软骨细胞增殖和分化中的作用。研究采用了实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、CCK-8、EdU、流式细胞术、生物信息学预测、双荧光素酶报告基因实验和拯救实验。miR-10955-5p过表达促进了软骨细胞增殖和分化并减少了凋亡，而抑制miR-10955-5p则产生相反效应。肌醇三磷酸3-激酶B（ITPKB）被鉴定为miR-10955-5p的直接靶基因。ITPKB过表达抑制了软骨细胞增殖和分化，而miR-10955-5p与ITPKB共过表达则部分逆转了这些抑制效应。这些发现表明，miR-10955-5p至少部分通过抑制ITPKB表达来正向调控软骨细胞增殖和活力。miR-10955-5p-ITPKB轴为TD中软骨细胞功能障碍的分子调控提供了新见解，并可能作为进一步研究的潜在分子靶点。

论文解读：miR-10955-5p靶向ITPKB调控福美双诱导胫骨软骨发育不良软骨细胞增殖与分化

一、研究背景与科学问题

胫骨软骨发育不良（tibial dyschondroplasia, TD）是快速生长型肉鸡和火鸡中一种常见的生长板发育性疾病，自1965年首次被描述以来，一直是集约化家禽生产中腿部健康的重要威胁。在肉鸡群中其发病率可接近30%，在火鸡中可达36%。患病家禽常表现出运动障碍、步态异常和跛行，严重病变可导致长骨变形、肢体角度异常甚至骨折。活动能力下降会限制采食和饮水，增加淘汰和宰前死亡风险，同时损害生长性能、饲料效率和胴体价值，严重情况下经济损失可达10%–40%。此外，持续疼痛和活动受限还引发严重的动物福利问题。因此，阐明TD的生物学基础并制定改善腿部健康的有效策略，是现代家禽育种和管理的重要优先事项。

microRNA（miRNA）是一类小型内源性非编码RNA，主要通过mRNA降解或翻译抑制来调控基因表达。越来越多的证据表明，miRNA通过调控软骨细胞增殖、肥大分化、凋亡和细胞外基质周转，是软骨发育和骨骼稳态的重要转录后调控因子。然而，在肉鸡胫骨软骨发育不良中，特定miRNA的功能和下游机制仍知之甚少。肌醇-1,4,5-三磷酸3-激酶B（inositol-1,4,5-trisphosphate 3-kinase B, ITPKB）催化IP₃磷酸化生成IP₄，通过控制IP₃的可用性来调节多种细胞类型中IP₃依赖的细胞内Ca²⁺信号。ITPKB的失调与免疫和神经系统疾病有关，且已有研究证明ITPKB可被miRNA转录后调控并参与细胞增殖、存活和疾病进展的控制。然而，ITPKB是否在鸡软骨细胞中受miRNA调控并参与福美双诱导的TD，此前尚不清楚。基于前期转录组测序发现miR-10955-5p在TD软骨中表达下调，本研究旨在探讨miR-10955-5p和ITPKB对TD软骨细胞增殖、凋亡和分化的影响，并确定ITPKB是否介导miR-10955-5p的生物学功能。

二、研究内容与主要结论

研究人员利用福美双诱导的TD肉鸡模型，分离培养TD软骨细胞，通过体外功能实验系统研究了miR-10955-5p和ITPKB在TD软骨细胞增殖、凋亡和分化中的作用及其相互调控关系。研究得出以下主要结论：miR-10955-5p在TD软骨组织和软骨细胞中显著下调，过表达miR-10955-5p可促进软骨细胞增殖和分化并减少凋亡，而抑制miR-10955-5p则产生相反效应；ITPKB被证实为miR-10955-5p的直接靶基因，其表达在TD中上调，且功能上抑制软骨细胞增殖和分化；拯救实验表明恢复ITPKB表达可部分逆转miR-10955-5p过表达对软骨细胞增殖和分化的促进作用。这些发现首次揭示了miR-10955-5p-ITPKB轴作为TD中软骨细胞功能障碍的调控通路，为理解TD的转录后调控机制提供了新见解，并为改善肉鸡腿部健康提供了潜在的分子靶点。

三、主要技术方法

研究人员从四川农业大学家禽育种场获取50只1日龄天府肉鸡，3日龄时随机分为对照组和TD组（n=25），TD组在标准日粮中添加50 mg/kg福美双诱导TD，10日龄时出现跛行症状后采集胫骨近端生长板软骨，分离培养原代软骨细胞。研究采用的主要技术方法包括：免疫荧光染色鉴定软骨细胞表型；RT-qPCR检测基因表达；CCK-8和EdU实验评估细胞活力和增殖；流式细胞术分析细胞周期和凋亡；利用RNAhybrid、TargetScan和miRanda三种算法预测miR-10955-5p的靶基因；双荧光素酶报告基因实验验证miR-10955-5p与ITPKB 3′UTR的直接结合；Western blot检测蛋白表达；以及拯救实验验证ITPKB对miR-10955-5p功能的介导作用。

四、研究结果

4.1 鸡TD软骨细胞表型的鉴定

研究人员通过免疫荧光染色对分离的原代细胞进行鉴定，结果显示分离的细胞呈现强烈的II型胶原（Col II）胞质染色，DAPI清晰显示细胞核，二抗阴性对照无明显荧光信号，证实所分离细胞具有典型的软骨细胞表型。

4.2 miR-10955-5p促进TD软骨细胞增殖并限制凋亡

RT-qPCR结果显示，TD组胫骨软骨组织和原代软骨细胞中miR-10955-5p表达均显著低于对照组。转染miR-10955-5p mimics和inhibitor分别有效上调和下调其表达。CCK-8实验表明miR-10955-5p过表达在24 h显著提高细胞活力，而抑制则显著降低24 h和36 h的细胞活力。EdU实验显示过表达miR-10955-5p增加EdU阳性细胞比例，抑制则减少。增殖相关基因CyclinD1、PCNA和CDK2的mRNA水平随miR-10955-5p过表达而升高、随抑制而降低。细胞周期分析显示，miR-10955-5p过表达减少G0/G1期细胞比例并增加G2/M期比例，而抑制则相反。凋亡检测表明，miR-10955-5p过表达显著降低总凋亡率并减少Caspase 9、Caspase 3和Bax的mRNA水平，而抑制则增加早期凋亡细胞比例并上调凋亡相关基因表达。

4.3 miR-10955-5p促进TD软骨细胞分化

研究人员通过RT-qPCR和Western blot检测分化相关标志物，发现miR-10955-5p过表达显著提高Col I、Col II和Col X的mRNA和蛋白水平，而miR-10955-5p抑制则降低这些标志物的表达，表明miR-10955-5p正向调控TD软骨细胞的分化相关细胞外基质表达。

4.4 miR-10955-5p直接靶向ITPKB

通过RNAhybrid、TargetScan和miRanda三种算法预测，ITPKB被选为候选靶基因，其3′UTR含有miR-10955-5p的推定结合位点。双荧光素酶报告基因实验证实，miR-10955-5p mimics显著降低含野生型ITPKB 3′UTR报告载体的荧光素酶活性，而种子匹配序列突变则消除此抑制效应。RT-qPCR和Western blot结果显示，miR-10955-5p过表达降低ITPKB mRNA和蛋白水平，抑制则升高，证实ITPKB是miR-10955-5p的直接靶基因并被负向调控。

4.5 ITPKB抑制TD软骨细胞增殖并改变细胞周期进程

RT-qPCR显示ITPKB在TD胫骨软骨组织和软骨细胞中表达显著高于对照组。功能实验表明，ITPKB过表达在36 h和48 h显著降低细胞活力，而ITPKB敲低在24 h和36 h提高细胞活力。EdU实验显示ITPKB过表达减少增殖细胞比例，敲低则增加。增殖相关基因Cyclin D1、PCNA和CDK2的mRNA水平随ITPKB过表达而降低、随敲低而升高。细胞周期分析显示，ITPKB过表达减少G0/G1和G2/M期细胞比例并增加S期比例，敲低则产生相反分布。凋亡相关基因检测显示ITPKB过表达上调Caspase-9、Caspase-3和Bax的mRNA水平，敲低则下调，但流式细胞术未检测到早期、晚期或总凋亡细胞比例的显著变化，表明ITPKB虽改变凋亡相关基因转录但未在检测条件下诱导明显凋亡表型。

4.6 ITPKB抑制TD软骨细胞分化

RT-qPCR和Western blot结果显示，ITPKB过表达显著降低Col I、Col II和Col X的mRNA和蛋白水平，而ITPKB敲低则增加这些基因的表达，表明ITPKB负向调控TD软骨细胞分化相关细胞外基质和肥大标志物的表达。

4.7 ITPKB拮抗miR-10955-5p对TD软骨细胞增殖和分化的效应

拯救实验显示，与miR-10955-5p mimic和空载体共转染的细胞相比，miR-10955-5p mimic与pcDNA3.1-ITPKB共转染显著降低了增殖相关基因Cyclin D1、PCNA和CDK的mRNA水平，并减少了EdU阳性细胞比例。同时，ITPKB过表达也显著降低了miR-10955-5p过表达诱导的Col I、Col II、Col X、SOX9、ACAN和MMP13的mRNA水平。这些结果表明恢复ITPKB表达可部分逆转miR-10955-5p对TD软骨细胞增殖和分化相关反应的促进作用。

五、讨论与结论

讨论部分指出，TD是快速生长家禽中主要的骨骼疾病，以软骨内成骨缺陷为特征，导致胫骨近端生长板中无血管和矿化不良的软骨积聚。福美双给药被广泛用于建立实验性TD模型。本研究通过功能实验证实miR-10955-5p直接调控TD软骨细胞行为，为生长板功能障碍中特定转录后调控机制提供了功能证据。miRNAs在骨骼发育和骨代谢稳态中具有重要调控作用，先前研究已证明miR-206a-3p和miR-1737在福美双诱导TD中调控软骨细胞增殖、分化和凋亡。本研究进一步鉴定miR-10955-5p-ITPKB轴为新的调控通路。ITPKB可能通过其在磷脂酰肌醇依赖性Ca²⁺信号中的作用，即转化IP₃为IP₄并调节细胞内Ca²⁺动态，来影响软骨细胞功能，但该机制仍属推测，需进一步研究ITPKB-IP₃/IP₄-Ca²⁺轴在软骨细胞中的潜在贡献。研究结论部分指出：本研究鉴定miR-10955-5p为鸡TD中软骨细胞功能的重要调控因子。miR-10955-5p在TD软骨和软骨细胞中下调，而ITPKB呈相反表达模式。功能分析证明miR-10955-5p促进软骨细胞增殖和分化相关反应并减少凋亡。ITPKB被确认为miR-10955-5p的直接靶基因，拯救实验表明恢复ITPKB表达可部分逆转miR-10955-5p的效应。这些发现表明miR-10955-5p-ITPKB轴参与TD中软骨细胞稳态的调控。但功能证据主要基于体外实验，该调控轴的剂量依赖效应和体内相关性仍有待确定，需利用福美双诱导TD模型进一步验证调控miR-10955-5p或ITPKB是否影响TD病变严重程度，并阐明其在骨骼发育中的生理意义。