《Vaccines》：EvoSet-NeoVax: Label-Blind Evidence Weighting, Constrained Set Selection and Junction-Optimised mRNA Design for Personalised Neoantigen Vaccines
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摘要
背景/目的： 个性化新抗原（neoantigen）疫苗现可在数周内完成生产，因此患者所接受的疫苗取决于选择了哪些突变。候选物的筛选围绕预测的肽-MHC结合进行组织，然而，呈递还要求突变被转录、由足够多的肿瘤细胞携带，并且受恶性细胞仍表达的HLA等位基因限
摘要
背景/目的： 个性化新抗原（neoantigen）疫苗现可在数周内完成生产，因此患者所接受的疫苗取决于选择了哪些突变。候选物的筛选围绕预测的肽-MHC结合进行组织，然而，呈递还要求突变被转录、由足够多的肿瘤细胞携带，并且受恶性细胞仍表达的HLA等位基因限制。疫苗是一个集合而非排序列表，其表位最终必须连接成一个单一构建体。EvoSet-NeoVax将这三个问题整合到一个标签盲（label-blind）工作流程中。方法： 公共新抗原和非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer, NSCLC）数据在一个保留缺失值的类型化模式（typed schema）下进行了协调统一，并在经过审计的泄漏控制（leakage control）下进行划分，用于冻结六个比较模型。结果： 一个感知缺失的逻辑回归（logistic regression）模型在包含30个候选物的内部测试分区上达到了0.869的精确率-召回率曲线下面积（precision-recall AUC, PR-AUC），是六个模型中在所有五个指标上表现最佳的，尽管在十五次两两比较中没有任何配对差异能在Holm校正后幸存。在外部TESLA数据集上，所有六个模型的性能均降至随机水平，接收者操作特征曲线下面积（receiver-operating-characteristic area, ROC-AUC）介于0.401至0.484之间。将预测结合与患者内表达、变异等位基因频率（variant allele frequency, VAF）和免疫肽组学（immunopeptidome）证据相结合，为患者A144在五个保留的HLA等位基因和两个HLA类别中选出了二十条肽记录，对应十九个基因中的十九个突变，其中十八个通过了天然侧翼验证并进入了最终模块；无一与经审核的人类蛋白质组完全匹配。在此候选池上，一个独立排序的top-K基线无法满足组合约束，而针对该队列68个ELISpot结果的回顾性比较也未区分两种排序方法。连接特异性接头优化将高优先级下的预测接头重叠窗口从18个减少到11个，弱优先级下从88个减少到42个，优化后的模块被编码为三个开放阅读框（open reading frames, ORFs），长度分别为744、633和531个核苷酸，通过了精确翻译回检，折叠自由能分别为?268.20、?204.10和?178.80 kcal/mol，并在计算机模拟中克隆到了一个经Addgene验证的T7骨架载体中，实现了插入片段的精确回收。结论： EvoSet-NeoVax提供了一个可重复的框架，用于将肿瘤基因组学证据转化为序列验证的、可直接合成的个性化新抗原疫苗构建体。
1. 研究背景与现存问题
个性化新抗原疫苗利用肿瘤细胞特有的体细胞突变产生的异常肽段，能够激发针对性的T细胞免疫应答，且避免了攻击正常组织的风险。非小细胞肺癌（NSCLC）因其高突变负荷和免疫检查点抑制剂的临床获益相关性，成为研究此类疫苗的理想疾病模型。尽管mRNA疫苗平台的发展使得快速生产成为可能，但决定疫苗疗效的核心瓶颈在于如何从患者肿瘤测序数据中选择合适的突变作为疫苗靶点。
当前的主要挑战有三：其一，候选物筛选过度依赖预测的肽-MHC结合亲和力，但忽略了突变必须被转录、存在于足够比例的肿瘤细胞中、并由肿瘤仍表达的HLA分子呈递等生物学前提，导致许多排名靠前的候选物实际上不具备免疫可见性。其二，疫苗是一个容量固定的集合而非排序列表，现有方法独立优化单个候选物，易导致选择的表位集中于少数基因或单一HLA等位基因，缺乏多样性和广度。其三，当选定的表位被组装成物理构建体时，连接序列会产生新的潜在结合表位，可能与目标表位竞争，影响疫苗的加工和呈递效率。目前，证据加权、集合选择和构建体设计通常被当作相互分离的问题来处理。
2. 研究内容与结论
为应对上述挑战，研究人员开发了EvoSet-NeoVax框架，旨在将肿瘤基因组学证据转化为可直接合成的疫苗构建体。该研究基于公开的新抗原数据和NSCLC患者队列数据，建立了一个完整的、可复现的工作流。主要结论包括：通过整合预测结合、患者内表达、变异等位基因频率和免疫肽组学证据的标签盲评分，能够选择出更具生物学合理性的候选物集合；采用约束多目标优化方法进行集合选择，可以确保疫苗在质量、多样性、HLA和基因广度上的平衡；通过连接子优化和天然侧翼恢复策略，能够显著减少因连接产生的新生结合表位，并成功设计出序列验证过的、可直接用于体外转录的mRNA开放阅读框。该框架为个性化新抗原疫苗的理性设计提供了端到端的解决方案。
3. 关键技术方法
研究人员采用了多项关键技术方法。首先，对来自ITSNdb、TESLA、TSNAdb v2、IEDB和Nicholas等人发表的NSCLC队列等五个公开数据源进行了数据协调与标准化，建立了保留缺失值生物学意义的类型化模式。其次，实施了泄漏控制分区，通过基于肽序列同一性（0.8阈值）的聚类和患者联合查找，确保训练、验证和测试集间无信息泄露。第三，训练了六个候选物水平的比较模型，包括经典机器学习模型（逻辑回归、随机森林、XGBoost）、肽序列神经网络（卷积网络和Transformer）以及一个多任务模型，并在内部和外部数据集上进行评估。第四，提出了一个标签盲的免疫可见性评分，综合了pVACseq预测排名百分位数、患者内RNA表达百分位数、DNA变异等位基因频率百分位数和免疫肽组学证据百分位数。第五，应用约束多目标集合选择，通过贪心算法求解一个包含候选物质量、集合冗余度、HLA广度、基因广度和野生型相似性惩罚项的目标函数，并设定了容量、最小HLA等位基因数、每基因最大候选物数、肿瘤证据要求和排除丢失HLA等位基因等硬约束。最后，进行了多表位构建体设计与优化，包括结构预测、连接子筛选与重设计、人类蛋白质组特异性筛查以及基于密码子优化的mRNA开放阅读框设计。
4. 研究结果
4.1. 一个工作流将公共变异呼叫转化为可合成序列
研究人员固定了从公共数据集到编码序列的路径，明确了六个执行阶段：校验和锁定的公共数据源、规范化表格、泄漏审计分区、标签盲可见性评分、约束集合选择和连接优化的mRNA开放阅读框。可见性评分中，预测结合权重为0.45，三项肿瘤证据（RNA表达、DNA VAF、免疫肽组学）总权重为0.55。
4.2. 一个带有审计分区的协调基准
对ITSNdb数据源的协调产生了199个配对的候选物，通过肽聚类分区获得了30个测试集候选物（18阳性，12阴性）。泄漏审计确认测试集与训练集间无序列重叠。
4.3. 共同分区上的六个冻结模型
在内部测试集上，感知缺失的逻辑回归模型在所有五个指标上表现最佳：PR-AUC为0.869，ROC-AUC为0.796，马修斯相关系数为0.365，Brier评分为0.182，期望校准误差为0.117。虽然没有任何两两比较的差异在多重检验校正后达到统计显著性，但透明可解释的逻辑回归模型未被任何神经编码器超越。SHAP归因分析显示，模型主要依赖突变体和野生型肽的描述及其变化。
4.4. 冻结模型的外部迁移
将六个冻结模型应用于外部TESLA数据集（706个候选物，31个阳性）时，所有模型的ROC-AUC均在0.401至0.484之间，接近随机水平，表明模型在不同分布的数据集上泛化能力有限。
4.5. 标签盲评分为患者A144选择了一个多样化集合
对于患者A144，标签盲评分和约束选择器从其候选池中选出了一个包含20个候选物的集合。该集合涵盖了7个I类和13个II类表位，分布于19个基因，由5个保留的HLA等位基因（HLA-A29:02, HLA-B44:02, HLA-B*44:04, HLA-DRB1 * 04:01, HLA-DRB1 * 13:01）限制。敏感性分析显示，独立的top-K排序无法在此候选池上返回可行集合，而本研究的贪心求解器能稳定地提供多样化且满足约束的集合。
4.6. 与实测ELISpot结果的回顾性比较
在回顾性比较中，标签盲评分和pVACseq排序在5个阳性患者（共8个阳性肽）上均未能在召回率指标上区分彼此。在连续终点（阳性肽的中位排名百分位数）上，pVACseq为0.322，可见性评分为0.347，差异不显著。
4.7. 盲法试剂面板和干净的蛋白质组筛选
生成了一个包含51种试剂的盲法肽面板用于功能测试。所有20个选定的突变肽在UniProt审核人类蛋白质组中均无精确匹配，确认了其肿瘤限制性。
4.8. 多表位构建体的结构和呈递审计
对三种抗原构建体进行了AlphaFold结构预测和置信度审计。A144-MEV-03（使用GGGGS柔性接头的构建体）在平均pLDDT、平均预测对齐误差和模型间一致性方面表现最优，被选作后续优化基础。人群覆盖率估算显示，五个限制性等位基因在全球范围内的综合覆盖率为28.54%。
4.9. 连接子筛选与重设计
通过IEDB推荐预测器对连接子进行筛选，使用加权连接风险公式（W = 10·nhigh + 2·nweak）为每个连接选择最优接头。优化后的构建体A144-MEV-03R长度为350个残基，将高优先级连接子重叠窗口从18个降至11个，弱优先级窗口从88个降至42个。
4.10. 天然侧翼平台重设计
对19个独特突变进行天然侧翼恢复，其中18个通过验证门控，生成了含有15个天然侧翼残基的长肽。这些长肽被划分为三个抗原模块（一个I类模块和两个II类模块），并进行连接子再优化。
4.11. 研究性开放阅读框设计
通过确定性密码子选择程序，将三个优化后的抗原模块转换为mRNA开放阅读框。三个设计（A144-mRNA-IR, -II-1R, -II-2R）分别编码744、633和531个核苷酸，均通过精确翻译回检，无存活回避基序，并使用TGA终止密码子。计算机模拟克隆显示，它们能被精确插入pGEM4Z-T7骨架载体中。
5. 讨论与结论
讨论部分： 本研究提出的EvoSet-NeoVax框架解决了现有新抗原疫苗设计流程中将证据加权、集合选择和构建体设计相分离的问题。通过将肿瘤证据整合进评分而非作为事后过滤，该方法更准确地反映了候选物的生物学潜力。约束集合选择确保了疫苗的多样性和广度，这对于克服肿瘤异质性和免疫逃逸至关重要。连接子优化有效减少了非目标表位的产生。然而，研究也存在局限性：内部模型比较由于样本量小（30个测试候选物）而统计效力不足；外部迁移性能不佳，突显了当前训练数据（ITSNdb）与临床应用场景之间的差距；回顾性ELISpot分析受限于极小的阳性事件数和预先筛选的检测候选物，无法得出关于临床效能的结论。
结论： EvoSet-NeoVax提供了一个可重复的框架，用于将肿瘤基因组学证据转化为序列验证的、可直接合成的个性化新抗原疫苗构建体。该工作流从公共变异呼叫开始，经过数据协调、标签盲评分、约束集合选择和连接优化，最终产出三个mRNA开放阅读框。虽然模型在外部数据集上的泛化能力和回顾性分析中的区分度有待提高，但该框架本身为个性化癌症疫苗的理性设计和标准化评估奠定了坚实基础。
