面向非洲低成本本地化生产的新型冻干减毒麻疹–风疹（MR）疫苗配方开发与稳定性评价

《Vaccines》：Development of a New Lyophilized Live-Attenuated Measles–Rubella (MR) Vaccine Formulation Designed for Lower-Cost Production in Africa

　　

背景/目标：本研究描述一种新型冻干减毒麻疹–风疹（MR）疫苗配方的开发，该配方设计用于非洲低成本生产。该配方由稳定剂溶液（stabilizer solution；仅含非动物源辅料（non-animal-derived excipients））与高滴度MR病毒原液（viral bulks；由现代化工艺在MRC-5细胞（MRC-5 cells）中生产）分别按95%和5%（v/v）比例配制而成。方法：研究人员开发了实验室规模和中试规模冷冻干燥（lyophilization）循环，实施了基于高通量逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription-quantitative PCR, RT-qPCR）的病毒感染力测定（viral infectivity assay），并采用有效的辅料筛选（excipient screening）条件以鉴定MR病毒的稳定化添加剂。基于筛选出的候选物，设计、制备候选冻干MR配方，并通过比较储存稳定性评估进行评价。结果：首先，避免使用蛋白类填充剂（许多商业化冻干含MR疫苗使用），而采用蔗糖/甘露醇（sucrose/mannitol）混合物。第二，筛选约50种辅料，并鉴定出另外两种关键稳定组分（两者此前均报道可稳定MR病毒）：磷酸钠缓冲液（sodium phosphate buffer）和尿素（urea）。接下来，对候选冻干MR配方的不同变体进行稳定性评估，以阐明蔗糖–甘露醇比例、饼块完整性与MR病毒稳定性之间的相互关系。建立了优化MR疫苗配方组成（复溶后）为5%（w/v）甘露醇、5%（w/v）蔗糖、50 mM尿素、25 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.5）和5%（v/v）病毒原液。当该配方以单剂量（single-dose）形式在实验室规模冻干时，两种MR病毒在实时（real-time）和加速（accelerated）条件下储存期间均显示出有前景的稳定性特征。随后，在试点规模（pilot-scale）冷冻干燥机中评估五剂量（multidose）形式，采用2X配方灌装至较大西林瓶，冻干后复溶至1X浓度。结论：结果表明，一种新的低成本冻干多剂量MR配方具有可行性，可能用于针对非洲本地生产的减毒活MR候选疫苗。

研究背景与问题：麻疹病毒（MeV）是自然界最具传染性的病毒之一，R₀为9–18，尤其在资源匮乏地区造成较高发病和死亡；其可急性抑制免疫系统并导致“免疫失忆”。风疹病毒（RuV）R₀为4–7，但妊娠早期感染约90%可发生胎儿传播，导致先天性风疹综合征（CRS），是疫苗可预防出生缺陷的主要原因。尽管含MR疫苗高效，中低收入国家（LMICs）尤其是WHO非洲区（AFRO）疾病负担仍高，疫苗覆盖存在缺口，原因涉及冷链和卫生基础设施、制造与物流成本、维持消除后覆盖困难，以及辅料相关过敏和文化/宗教顾虑。配方相关障碍包括：MR生产能力有限、需要更高滴度原液；减毒活MR疫苗不稳定，需稳健冻干工艺并适配大体积多剂量；人血清白蛋白（HSA）或重组人血清白蛋白（rHSA）、动物源明胶或乳糖等辅料成本高、来源困难或存在过敏及宗教合规问题。因此，研究人员开发含非动物源辅料、适配冻干、低成本且可用于非洲本地化生产的MR配方。研究利用在MRC-5细胞中由新工艺生产的高滴度MeV和RuV原液，目标包括非动物源稳定剂、良好冻干产量和2–8 °C储存稳定性、通过欧洲药典（EP）热稳定性试验（37 °C 1周滴度损失≤1 log）并获得VVM14标识、复溶后短期稳定。结论表明该低成本冻干多剂量MR配方具有可行性，对非洲本地生产具有意义。

关键技术方法（≤250字）：研究采用实验室规模VirTis Advantage和中试规模LyoStar 4冷冻干燥循环；以基于RT-qPCR的效价qPCR（potency qPCR, PqPCR）测定MeV和RuV病毒感染力；筛选约50种辅料，并评估冻干损失、37 °C热应激损失及复溶后2–8 °C 8 h损失；同时表征饼块质量、残余水分、复溶时间、调制差示扫描量热法（mDSC）测玻璃化转变温度、渗透压和偏振光显微镜（PLM）等物理性质，并以线性回归外推货架期和VVM。研究所用高滴度MeV Edmonston–Zagreb（EZ）株和RuV Wistar RA 27/3株原液由Batavia Biosciences（BBS, Leiden, The Netherlands）用MRC-5细胞新工艺生产，靶向Institut Pasteur de Dakar（IPD, Senegal）本地生产；Vero细胞（ATCC CCL-81）用于感染力测定。

研究结果：
3.1 开发用于辅料筛选的实验室规模冻干循环：研究人员建立保守冻干循环，饼块质量优、残余水分0.9±0.1%、复溶<30 s，冻干相关MR滴度损失约0.1–0.3 log，处于测定变异范围内，支持后续辅料筛选。
3.2 评估从冻干单价MeV配方中去除rHSA：在含或不含0.6 mg/mL rHSA的单价MeV配方中，冻干前后及37 °C 3天和7天热应激后滴度无统计学显著差异（p>0.05），支持在新稳定剂中排除rHSA。
3.3 鉴定使用非蛋白类辅料的冻干填充剂：测试山梨醇、蔗糖或海藻糖单独及联合PEG3350或甘露醇，所有配方饼块质量优；糖/多元醇单独稳定不足，10%蔗糖+5%甘露醇最稳，37 °C 3天损失MeV 1.0、RuV 0.8 log，确定基线配方。
3.4 通用辅料筛选以鉴定额外稳定辅料：在基线中加入47种添加剂，仅尿素和硫脲进一步稳定MeV和RuV；MeV特异稳定剂包括苹果酸、柠檬酸钠和氨基酸混合物，RuV特异稳定剂包括组氨酸和PVP K-30。因尿素已用于多种许可人用减毒活疫苗，选择尿素，50 mM为最优。
3.5 调整蔗糖–甘露醇比例以优化病毒稳定性与冻干饼块物理完整性：改变蔗糖/甘露醇比例及添加其他填充剂；高甘露醇下增加蔗糖改善稳定性但降低饼块质量，10%蔗糖/5%甘露醇稳定性最佳但饼块最差；其他填充剂改善饼块但损害稳定性或有小趋势。选定候选1（2.5%蔗糖/5%甘露醇）、候选2（5%/5%）、候选3（5%/7.5%），总损失约0.5–0.9 log，饼块2–3分。
3.6 确认候选MR配方的最佳缓冲盐：候选2配方使用25 mM磷酸钠、组氨酸、HEPES或柠檬酸钠，饼块相似；磷酸钠在配方、冻干和37 °C 7天热应激中的MeV和RuV总损失最小，优于其他缓冲盐。
3.7 实时、加速和应激稳定性研究：三候选配方头对头比较，T0饼块3分，37 °C 7天后2–3分；残余水分1.0–1.2%，Tg约17–20 °C，热应激后分别约28±1、25±4、21±1 °C；复溶约<30–95 s，渗透压约525、572、682 mOsm/kg；冻干损失约?0.1–0.3 log，37 °C 7天损失<1.0 log，满足EP；复溶8 h损失MeV ?0.1–0.0 log、RuV约0.3 log；10个月线性回归显示候选2损失率最低，2–8 °C为MeV 0.01、RuV 0.02 log TCID₅₀/mL/月，15 °C为0.03/0.03，25 °C为0.11/0.16。
3.8 冻干候选2 MR疫苗配方的额外稳定性评价：基于10个月实时和12周加速数据外推，18个月2–8 °C损失MeV 0.2、RuV 0.4 log，下95%置信区间约0.3/0.7 log；25 °C 3个月损失MeV 0.3、RuV 0.5 log，下95%置信区间约0.4/0.8 log，低于1.0 log阈值，预计VVM14；饼块以无定形为主，Tg′/Tg″呈双相，PLM未检出甘露醇晶体。
3.9 冻干候选2 MR疫苗配方的多剂量可行性研究：实验室规模1X、1.5X、2X单剂量冻干后复溶至1X，饼块3分、残余水分<2%、T0复溶<30 s、热应激后50–103 s，冻干损失?0.1–0.2 log，37 °C 7天损失0.3–0.7 log，≤1.0 log，渗透压300–600 mOsm/kg；中试5剂量4R瓶1.5X/2X（2.25/1.5 mL）复溶至3 mL，饼块3分、残余水分<2%，复溶分别61±35/105±35 s和132±32/181±43 s，Tg分别34±2/35±1 °C，Tg″约?50±1 °C，冻干损失0.1–0.3 log，37 °C 7天损失0.3–0.7 log，复溶8 h损失0.1–0.2/0.1 log；退火步骤未改善饼块或稳定性。

讨论总结：讨论指出，扩展双价MR疫苗可及性是改善LMICs尤其是AFRO覆盖的重要措施；常规冻干瓶装多剂量优化与微针阵列贴片（MAP）等新剂型并行仍具价值。配方开发挑战包括减毒活MeV/RuV本身不稳定、感染力测定变异大，以及冻干饼块质量与病毒稳定性之间的平衡；传统TCID₅₀等质控（QC）方法通量低，故采用PqPCR支持配方开发。高滴度MRC-5细胞来源原液使病毒原液仅占5%（v/v），稳定剂占95%（v/v），既利于冻干又减少原液残留；MeV原液不含rHSA，使研究人员可独立评估rHSA作用并支持排除rHSA以降低成本。配方选择非动物源、易采购辅料，避免HSA/rHSA、明胶/乳糖相关成本和过敏/宗教问题；磷酸盐、蔗糖、甘露醇和尿素为关键辅料，磷酸盐稳定MR但需注意冻融pH效应，蔗糖可缓解；蔗糖–甘露醇比例影响稳定性与饼块完整性；尿素为筛选出的首选稳定添加剂。多剂量可简化物流和降低单剂成本，但大瓶冻干存在热渗透不均、复溶较慢和氧化风险；候选2多剂量饼块质量优、Tg较高、稳定性相似或更好，并预测2–8 °C至少18个月和VVM14。未来需以TCID₅₀质控法确认、开展更大规模多批次、容器封闭完整性、非洲原料采购、辅料质量标准以及非临床和临床评价。

研究结论翻译：本研究描述并评价了一种旨在降低成本的新型冻干MR疫苗配方。研究人员利用由新生产工艺在MRC-5细胞中生产的高滴度MR病毒原液，筛选约50种辅料对冻干MeV和RuV的稳定能力；据此设计含5%（v/v）病毒原液和95%（v/v）稳定剂溶液的新MR配方，稳定剂由非动物源辅料组成，即5%蔗糖、5%甘露醇、50 mM尿素和25 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.5）。蔗糖–甘露醇比例优化被确定为平衡病毒稳定性与饼块物理完整性的关键参数。为降低成本，本研究确认稳定剂溶液不需要rHSA，且多剂量形式可行并显示初步有希望的结果。使用替代RT-qPCR病毒感染力测定的实验室规模稳定性研究显示，2–8 °C估计货架期至少18个月、VVM14标识，并具有可接受的冻干产量、复溶时间和溶液渗透压。除实验室规模概念验证外，未来实施该多剂量冻干MR候选疫苗仍需额外研究：例如以QC病毒滴度测定TCID₅₀开展类似稳定性研究，以确定储存和复溶条件、货架期预测、VVM和控温链（CTC）标识；此类研究宜在MR原液和药品工艺技术转移至非洲本地生产后，评估更大规模生产的多个MeV/RuV原液批次及使用优化快速冻干循环的多个多剂量MR配方批次；GMP生产研究可包括容器封闭完整性、非洲原材料采购和辅料质量标准（如尿素水解降解限度）；未来确认体内性能可能包括非临床安全性评估及临床安全性、免疫原性和有效性评价。