《Vaccines》：Deciphering the Immunoproteome of Mycobacterium tuberculosis in Pursuit of a Vaccine
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针对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）的适应性免疫应答尚未被完全阐明。对宿主免疫的更深入理解可能为研发有效的结核病疫苗作出重要贡献。大量研究已刻画了保护性免疫的基本组成要素，例如对强效CD4 T细胞应答的需求。近年来
针对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）的适应性免疫应答尚未被完全阐明。对宿主免疫的更深入理解可能为研发有效的结核病疫苗作出重要贡献。大量研究已刻画了保护性免疫的基本组成要素，例如对强效CD4 T细胞应答的需求。近年来，已发表的重要工作定义了人Mtb特异性T细胞和B细胞的抗原靶标，包括通过肽库和蛋白质微阵列技术对Mtb蛋白质组进行系统筛查，以鉴定迄今未知的抗原。这些研究发现，Mtb感染期间的人体免疫应答呈窄谱聚焦性，仅针对少数富集于分泌蛋白的抗原。本综述总结了当前关于Mtb免疫蛋白质组（immunoproteome）的知识，涵盖其组成及发现方法。本文讨论了通常在Mtb免疫应答中占据主导地位的抗原的身份与特征，以及该领域研究对结核病疫苗设计的启示。
主体内容总结
1. 引言
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）感染所致的结核病（TB）仍构成巨大的全球疾病负担，而有效疫苗的研发进展缓慢。其核心障碍在于保护性免疫的构成要素——即“保护相关性指标”（correlates of protection）——尚未被充分理解。基因组工具如靶向基因敲除技术已揭示CD4 T细胞是抗Mtb适应性免疫的核心介导者，B细胞及其他T细胞亚群发挥次要作用。蛋白质组-wide高通量筛选技术推动了Mtb抗原库（即“免疫蛋白质组”，immunoproteome）的发现，重点关注CD4+ T细胞和血清抗体识别的靶标。研究表明，Mtb感染宿主中的抗原特异性呈窄谱聚焦，仅针对Mtb完整蛋白质组（超过4000个翻译基因产物）中的一小部分。临床TB沿潜伏感染至亚临床和活动性疾病的谱系分布，T细胞和B细胞靶标与疾病状态密切相关。
2. TB自然史与免疫
结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC）包含至少10种密切相关的抗酸菌种。Mtb和非洲分枝杆菌（Mycobacterium africanum）是专性人类病原体。Mtb从环境微生物进化为人类病原体的关键步骤是获得了在自由生活的阿米巴原虫等原生动物内存活的能力。Mtb的生命周期始于进入气道并感染肺泡巨噬细胞，树突状细胞摄取并转运杆菌至纵隔淋巴结，通过主要组织相容性复合体（MHC）II类途径将外源抗原呈递给CD4 T细胞。在动物模型中CD8 T细胞对控制Mtb感染具有非冗余作用，但在人类中尚未证实。Mtb通过基因组缩减和核心毒力系统的扩张实现毒力优化，其中突出的包括VII型（ESX）分泌系统，其底物在Mtb免疫蛋白质组中占据显著地位。适应性TB免疫建立的一个主要限速步骤是抗原特异性CD4 T细胞到达肺部激活巨噬细胞产生干扰素-γ（IFN-γ）需延迟数周。肉芽肿形成后，持续的细菌抗原积累为CD4 T细胞提供潜在靶标，慢性过度炎症性T细胞最终驱动肺组织破坏和空洞形成。
3. 定义Mtb免疫蛋白质组的方法
早期抗原筛选依赖于将随机Mtb基因组DNA片段插入噬菌体构建重组表达文库。Young和Bloom的开创性工作使用λgt11噬菌体构建了DNA表达文库，将表达的蛋白质转移至硝酸纤维素膜并用抗Mtb抗原的单克隆抗体探测。后续研究将该方法用于评估TB患者混合血清的反应性。但此类方法存在局限性：可能偏向鉴定高表达抗原，文库构建可能无法实现全基因组覆盖，且抗体筛选只能间接识别T细胞抗原亚群。
血清学方法的重大改进是使用携带Mtb基因组约4000个开放阅读框（ORFs）体外翻译产物的微阵列进行更全面的抗体反应性筛选。Kunnath-Velayudhan等人用代表99%表达ORFs的蛋白质微阵列检测确诊TB患者、疑似病例和健康对照的血清，发现仅约10%的蛋白质组（484种蛋白质）与血清抗体反应，仅0.5%在活动性疾病中被高频识别。后续研究进一步确定了与活动性TB显著相关的10种蛋白质，富集于分泌型和细胞壁抗原。利用蛋白质组-wide微阵列，研究者绘制了不同TB疾病状态个体的抗体特异性图谱：在潜伏感染（LTBI）和活动性TB供体之间，有109种抗原差异表达，其中6种抗原的组合能以90%准确率区分这两组人群。
与抗体可直接结合靶标不同，CD4 T细胞需要抗原加工和呈递。研究者通常聚焦于预先选择的单个蛋白质或小规模相关抗原集合。一项早期研究基于MHC II类结合亲和力预测，对21个Mtb基因组的蛋白质序列进行比对，鉴定所有可能的15-mer肽段，并预测其与22种常见HLA-DR、-DP和-DQ等位基因的结合强度，共获得20,610条肽段。这些肽段以每池20条的形式合成并检测LTBI个体外周血单个核细胞（PBMCs）的IFN-γ产生。结果发现CD4 T细胞对Mtb抗原的识别集中于ESX和PE/PPE蛋白家族的表位。
在南非63名LTBI个体的队列中，一项定量分析评估了CD4 T细胞表位特异性的广度。使用覆盖11种已知免疫原性蛋白的重叠肽库，共鉴定出多达125个独特表位，单个供体平均识别24个来自最多8种抗原的独特表位，86%的供体识别至少一种抗原的表位，但没有任何单一抗原被所有供体识别。该团队将肽库扩展至包含三种BCG菌株和12种TB疫苗候选抗原的肽段后，发现TB患者共识别137个独特表位，平均每人8个（范围1-27个）。TB患者的应答广度较LTBI个体更窄，且某些表位仅被TB患者识别（如Rv1813c），而EsxV、Mtb32A和PPE42仅在LTBI组中反应。这表明从潜伏到活动性TB的转变不仅是T细胞应答强度的变化，还涉及表位的差异性识别。
Bettencourt等人采用不同方法，从BCG感染的巨噬细胞中纯化MHC-I和MHC-II复合物上的肽段。质谱分析显示MHC-II呈递的抗原以膜相关蛋白为主，这可能反映了BCG缺乏ESX-1位点（该位点编码免疫优势分泌抗原ESAT-6和CFP-10）。在Mtb感染的人树突状细胞上，MHC-II呈递的肽段以ESX分泌系统的分泌底物为主，包括CFP-10和各种PE/PPE蛋白，这些抗原具有免疫原性并能引发LTBI个体的T细胞应答。
上述研究的范围受限于仅关注外周循环中的T细胞。由于TB主要影响肺部，肺组织内驻留T细胞的抗原特异性可能与血液中循环的T细胞不同。小鼠模型中，黏膜鼻内BCG接种相比全身皮内接种在肺部产生更强的保护效果，形成了更高频率的抗原特异性组织驻留CD4 T细胞。在Mtb感染小鼠中，肺血管和肺实质中的CD4 T细胞功能存在差异，组织中的CD4 T细胞限制细菌生长的能力显著优于肺血管中的CD4 T细胞。
4. 免疫优势TB抗原的独特性质
B细胞和T细胞的特异性均富集于一小部分Mtb抗原，即所谓的免疫优势抗原。活动性TB患者的血清对约10%的Mtb蛋白质组有可检测水平的反应，但大部分抗体应答集中于仅13种蛋白质，其中大多数为分泌抗原，突出代表包括ESX-1的分泌底物CFP-10和EspB，以及通过通用Sec途径分泌的抗原85（Ag85）A。CD4 T细胞应答在潜伏感染和活动性TB期间集中于3个基因组区域（“抗原岛”），这些区域仅占Mtb ORFs的0.55%，却代表了LTBI供体总CD4 T细胞应答中42%的抗原靶标。这些区域包含ESX-3底物（如TB9.8和TB10.4）以及ESX-1底物（CFP-10和ESAT-6）。值得注意的是，最突出的B细胞和T细胞靶标之间几乎没有重叠。
Mtb免疫应答的窄谱聚焦伴随着抗原变异的缺乏。Mtb基因组高度稳定，缺乏其他人类传播和持续存在的细菌病原体中所见的抗原变异类型。跨物种分析显示Mtb的进化速率极低（每年每座位10-8次替换），远低于快速进化的鲍曼不动杆菌（10-5至10-6）。Comas等人的里程碑式研究证明，几乎所有已知的T细胞表位在Mtb中均高度保守，且大多数分布于分泌型免疫优势抗原中。在216株系统发育多样的Mtb菌株中，含T细胞表位的基因组区域比周围不含表位的区域更保守，78%的表位不含氨基酸替换。这与HIV-1和HIV-2等病原体在免疫压力下产生逃逸突变形成鲜明对比，提示Mtb的免疫优势抗原可能构成一种“诱饵”策略，诱导强烈但非最优的T细胞应答以利于细菌生存。
分泌型免疫优势抗原的另一个特征是抗原输出。Ag85B从Mtb感染的树突状细胞主动输出至细胞外空间，一方面将蛋白质从感染细胞的抗原加工和呈递途径中转移出去，另一方面使未感染的旁观者细胞捕获这些抗原并有效呈递给CD4 T细胞，从而将T细胞错误引导至未感染细胞并可能驱动远端健康组织的破坏性应答。分泌抗原的表达还受时间调控：ESAT-6和Ag85B的转录本在感染后第15天达峰后急剧下降，伴随抗原特异性肺T细胞的同期减少。这种时间调控意味着早期分泌可能将T细胞特异性偏向这些抗原，随后因同源抗原匮乏而使这些T细胞近乎失效。
5. Mtb免疫蛋白质组与其他细菌病原体的比较
关于其他细菌病原体免疫蛋白质组的文献十分有限。肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）展示文库筛选显示约140种蛋白质（约7%的蛋白质组）与血清抗体反应。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）全基因组蛋白质微阵列（2652种抗原）中，1086种抗原（41%）显示IgG反应性，但仅104种抗原在所有样本中具有强IgG反应性，且富集于分泌蛋白。伤寒沙门菌（Salmonella typhi）微阵列筛选中，2724种测试抗原中2442种为IgG反应性，但至少50%患者样本中仅38种抗原为IgG反应性，127种抗原被鉴定为血清优势抗原（约占测试抗原的4.7%）。沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）的908个ORFs中，709种蛋白质（78%）被至少一份样本识别，但仅27种抗原（约3%）被至少50%的样本识别。类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）预选1205种抗原中鉴定出170种反应性抗原，其中49种可区分类鼻疽患者与其他细菌感染患者。
在抗原保守性方面，肺炎链球菌的已知保护性表面抗原PspA和PspC具有高度多态性，免疫PspA可显著降低小鼠肺部细菌负荷。脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）的GNA2132（NHBA）在80个基因组中具有约83%的氨基酸序列同一性，且已成为多种已许可脑膜炎疫苗的组分。相比之下，Mtb免疫优势抗原的保守性达到异常高的水平，且免疫优势抗原在其他细菌病原体中可提供持久的免疫保护，而在Mtb中通常未观察到这种情况。
6. 亚优势或隐蔽抗原靶标在疫苗设计中的作用
BCG引入已逾百年，尚无新的TB疫苗获批用于临床。MVA85A（表达免疫优势抗原Ag85A的痘病毒载体）在南非婴儿中的2b期临床试验显示，在标准BCG接种基础上未提供额外保护效果。M72/AS01E亚单位疫苗（由Mtb32A和Mtb39A融合而成）的2b期试验报告对LTBI成人活动性肺结核有54%的保护效力，目前已进入3期试验。静脉注射BCG在猕猴中显著增加了组织驻留T细胞并在大多数动物中实现无菌保护。
为避免免疫优势抗原的潜在诱饵效应，有研究者提出使用亚优势抗原进行免疫的策略。亚优势抗原在自然感染中呈递较弱，但记忆T细胞识别同源抗原的激活阈值低于初始T细胞，因此弱呈递的抗原仍可能激发记忆T细胞的回忆应答。有研究显示，BCG免疫后4周给予亚优势核糖体蛋白抗原rplJ，可显著降低后续Mtb感染的肺病理损伤。另一项研究基于序列变异性选择了7种Mtb蛋白（可能为承受免疫压力的亚优势抗原），在肯尼亚LTBI队列中，其中4种可变抗原（LldD2、RimJ、Rv0010c和Rv0012）刺激的IFN-γ分泌CD4 T细胞应答低于经典优势抗原，但诱导更高比例的IL-17产生CD4 T细胞。此外，经典免疫优势抗原内部可能含有在某些条件下暴露的亚优势或隐蔽表位。删除ESAT-6中的主要CD4 T细胞表位后，免疫该突变蛋白可诱导针对隐蔽表位的应答，并在两种小鼠品系中显著降低肺部细菌负荷，隐蔽表位特异性CD4 T细胞表现出增强的增殖能力和多功能性（分泌IFN-γ、TNFα和IL-2）。
7. 结论与未来展望
TB流行造成严重的人力资本损失，亟需研发有效疫苗。Mtb免疫蛋白质组的鉴定为理解宿主-病原体相互作用和合理疫苗设计提供了重要基础。免疫应答对少数抗原靶标的窄谱聚焦可能构成诱饵机制，尤其是考虑到其中许多抗原的分泌特性。因此，从疫苗中排除这些推定诱饵抗原可能避免产生无效的记忆细胞。亚优势抗原值得更多关注，因为部分可诱导Th17细胞，在特定条件下与阻止TB疾病进展相关。未来需要更多工作来表征LTBI和活动性TB之间B细胞和T细胞抗原特异性的差异，特别是在高暴露环境中长期维持LTBI状态的个体，这可能为确定与保护性或病理性应答相关的抗原提供线索。最终，可行的TB疫苗可能需要整合多种相互强化的策略才能在现实环境中有效。
