《Diagnostics》：Correction: Reinoso et al. The Rise and Fall of Interventional Pulmonology Procedures: Lessons in Innovation, Evidence, and Abandonment. Diagnostics 2026, 16, 1981
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背景/目的：可扩展的分子工作流程可能有助于脊髓性肌萎缩症（SMA）和囊性纤维化（CF）的携带者筛查。本研究旨在开发并验证一种基于干血斑（DBS）的多重数字PCR（dPCR）工作流程，用于SMN1和SMN2拷贝数分析以及CFTR p.Phe508del的靶向检测
背景/目的：可扩展的分子工作流程可能有助于脊髓性肌萎缩症（SMA）和囊性纤维化（CF）的携带者筛查。本研究旨在开发并验证一种基于干血斑（DBS）的多重数字PCR（dPCR）工作流程，用于SMN1和SMN2拷贝数分析以及CFTR p.Phe508del的靶向检测。方法：该工作流程将直接DNA洗脱与多重dPCR相结合。分析验证使用了50份先前已表征的样本，以多重连接探针扩增技术（MLPA）和Sanger测序作为参考方法。该工作流程随后应用于希腊克里特岛和伊卡里亚岛的1670名女性，随后对10名伴侣进行了靶向检测。结果：所有50份直接洗脱样本均成功扩增。dPCR与参考方法完全一致。重复性变异系数低于5%。拷贝数分类性能估计为表观值，因为阈值是在同一小型验证队列中推导并评估的。在1670名接受筛查的女性中，34名（2.04%）被确定为SMN1携带者，20名（1.20%）为CFTR p.Phe508del携带者。伴侣检测识别出两对携带者夫妇。结论：基于DBS的多重dPCR工作流程在初步验证中显示出与参考方法的完全分析一致性，并已在人群筛查队列中实施。其靶向范围留下残余携带风险，需要适当的咨询。在常规实施之前，需要进行更大规模的独立验证以及正式的吞吐量和成本评估。
论文解读
一、研究背景与问题
脊髓性肌萎缩症（SMA）和囊性纤维化（CF）是较常见的严重常染色体隐性遗传病，携带者筛查有助于识别具有生殖风险的个体，促进知情生殖决策和遗传咨询。在欧洲裔人群中，CF携带频率约为1/25至1/30，SMA约为1/38至1/50。在希腊，SMA被描述为继血红蛋白病和CF之后第三常见的严重常染色体隐性遗传病，携带频率约为1/43，最低发病率约为1/12000活产儿。希腊已建立针对血红蛋白病和CFTR p.Phe508del的携带者筛查并纳入报销，但SMA携带者筛查尚未纳入。SMA主要由SMN1双等位基因缺失或致病性改变引起，SMN2拷贝数是疾病严重程度的重要修饰因子；CF中p.Phe508del是最常见的致病性CFTR变异，在希腊患者中约占CF等位基因的53.4%。然而，希腊CFTR突变谱具有异质性，仅检测p.Phe508del无法覆盖大多数携带者。目前希腊尚未建立全国性的SMA和CF生殖携带者筛查项目。干血斑（DBS）具有微创采集、简化运输储存和集中化处理等优势，数字PCR（dPCR）则适合拷贝数分析。此前已有基于DBS的SMN1拷贝数检测方法报道，但将DBS直接DNA洗脱与多重dPCR结合以同时分析多个遗传靶标的工作流程仍需进一步评估。
二、研究内容与结论
研究人员开发并验证了一种基于DBS直接洗脱的多重dPCR检测方法，用于SMN1和SMN2拷贝数分析及CFTR p.Phe508del靶向检测。分析性能以MLPA和Sanger测序为参考进行评估。该检测随后应用于希腊克里特岛和伊卡里亚岛1670名女性的生殖携带者筛查路径，并进行了靶向伴侣检测。结果显示，在50份验证样本中dPCR与参考方法完全一致，重复性变异系数低于5%。在1670名女性中，34名（2.04%）为SMN1携带者，20名（1.20%）为CFTR p.Phe508del携带者，伴侣检测识别出两对携带者夫妇。该研究证明了整合分子筛查、确认检测和遗传咨询的可行性，为希腊建立结构化、公共支持的生殖携带者筛查项目提供了初步依据。
三、关键技术方法
研究人员采用了以下主要技术方法：干血斑（DBS）样本采集与直接DNA洗脱，省去传统DNA提取步骤；多重数字PCR（dPCR）平台（QIAcuity）同时检测SMN1、SMN2、CFTR p.Phe508del和参考基因RPPH1；以多重连接探针扩增技术（MLPA）作为SMN1/SMN2拷贝数参考方法，以Sanger测序作为CFTR p.Phe508del参考方法。验证样本为2025至2026年间采集的50份已表征DBS样本，来自患者及其家属并已签署知情同意。人群筛查队列为2026年4月至8月间希腊克里特岛和伊卡里亚岛的1670名20至35岁女性，均为自愿参与。
四、研究结果
4.1 验证样本流程
50份验证样本均成功完成dPCR初始分析。6份SMN1 MLPA结果初始模糊的样本中5份经重复检测后明确，1份（C377）仍无法确定，故SMN1一致性分析纳入49份样本，SMN2和CFTR p.Phe508del分析纳入全部50份。
4.2 DNA产量与纯度
直接洗脱DNA的表观平均浓度为248.8±99.2 ng/μL，A260/A280比值为0.83±0.08；传统提取DNA平均浓度为78.2±27.5 ng/μL，A260/A280比值为1.47±0.07。直接洗脱产物中位RPPH1拷贝数为5136每40 μL反应（约2570个二倍体基因组当量），与分光光度法DNA浓度呈弱正相关（Spearman ρ=0.24）。直接洗脱产物纯度比值偏低提示存在非核酸成分干扰，其表观浓度不应视为真实DNA产量。
4.3 与参考方法的一致性
SMN1方面，49份可评估样本中dPCR与MLPA完全一致（49/49，100%，Cohen κ=1.00）。SMN2方面，50份样本完全一致（50/50，100%，κ=1.00）。CFTR p.Phe508del方面，dPCR与Sanger测序完全一致（50/50），灵敏度100%（8/8），特异性100%（42/42），所有阳性样本均为杂合子。
4.4 ROC分析与分类性能
ROC分析显示SMN1和SMN2相邻拷贝数类别之间完全分离，各分类边界AUC和Youden指数均为1.000。ROC推导的截断值分别为SMN1：0.47、1.39、2.56；SMN2：0.42、1.51、2.67。预设截断值0.5、1.5、2.5产生完全相同的分类结果。由于截断值在相同验证数据集中推导和评估，性能估计为表观值且可能偏乐观，需独立验证。仅3份样本的类别置信区间较宽（29.2–100%）。
4.5 重复性评估
8份参考样本各经3次独立DBS洗脱和dPCR分析。SMN1平均拷贝数估计范围为0.998至3.185，CV为1.3–4.8%，合并CV为2.6%；SMN2平均估计范围为0.879至2.074，CV为0.34–4.23%，合并CV为2.3%。所有样本在3次独立制备中均保持预期拷贝数分类，平均估计值与预期整数值偏差不超过0.22拷贝。
4.6 人群携带者筛查
1670名女性中，34名（2.04%，约1/49）为SMN1缺失携带者，20名（1.20%，约1/83）为CFTR p.Phe508del携带者，其中1名女性同时携带两种变异，共53名个体携带者。所有阳性结果均经新DNA制备重复并分别经MLPA（34/34）或Sanger测序（20/20）确认。55份样本（3.3%）需重复分析，原因包括有效分区不足（52份）或RPPH1扩增失败（3份），重复后均获得有效结果。10名伴侣接受检测，其中2名确认为携带者（1名SMN1缺失，1名p.Phe508del），识别出1对SMA携带者夫妇和1对CF携带者夫妇。操作上每日最多处理2块24孔纳米板（含对照最多48个反应），每板手工操作约1.5小时，结果通常在收到样本后10天内报告，需确认检测时延长至15天。
五、讨论与结论
讨论部分指出，直接DNA洗脱简化了样本制备，但传统提取用于参考方法，两者未进行正式比较，不能推断直接洗脱的优越性。分光光度法测量直接洗脱DNA需谨慎解读，低A260/A280比值提示非核酸成分干扰。SMN1拷贝数筛查存在残余携带风险，两拷贝结果不能排除携带者身份，希腊人群特异性残余风险尚待确定。CFTR部分仅限于p.Phe508del靶向检测，约占希腊CF等位基因的53%，阴性结果后残余携带风险估计约为1.1%至2.3%。在ACCE框架下，本研究主要解决分析有效性，未评估临床有效性和临床效用。局限性包括验证样本量小、部分类别代表性有限、ROC截断值未经独立验证、重复性仅基于8份样本、筛查队列局限于两个希腊岛屿的20至35岁女性且全部在单一实验室使用单一dPCR平台完成。
研究结论：本研究开发并初步验证了基于DBS直接洗脱与多重dPCR的工作流程，用于SMN1和SMN2拷贝数分析及CFTR p.Phe508del靶向检测。该工作流程在有限验证队列中与参考方法完全一致，并成功应用于1670名女性的筛查队列。伴侣检测识别出两对携带者夫妇，证明了分子筛查、确认检测和遗传咨询的实践整合。这些发现支持在希腊进一步发展结构化、公共支持的生殖携带者筛查项目，但检测的靶向性质留下残余携带风险，需通过适当咨询解决。更大规模的独立验证、更广泛的CFTR变异覆盖以及筛查接受度、操作性能、成本效益和临床结局的系统评估，是指导在常规公共卫生服务中实施所必需的。
