《Diagnostics》：Evaluation of Functional Activity of Ciliated Epithelium in Patients with Primary Ciliary Dyskinesia
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目的：本研究旨在运用多种方法对原发性纤毛运动障碍（PCD）患者进行诊断，这些方法包括遗传学分析、免疫荧光检测、透射电子显微镜（TEM）以及气-液界面（ALI）培养中纤毛摆动频率（CBF）的评估。方法：研究对象包括35例原发性纤毛运动障碍患者和10例健康对照（H
目的：本研究旨在运用多种方法对原发性纤毛运动障碍（PCD）患者进行诊断，这些方法包括遗传学分析、免疫荧光检测、透射电子显微镜（TEM）以及气-液界面（ALI）培养中纤毛摆动频率（CBF）的评估。方法：研究对象包括35例原发性纤毛运动障碍患者和10例健康对照（HC）。PCD的诊断通过分子遗传学分析（全外显子组测序WES）、透射电镜（TEM）、ALI培养物的免疫荧光染色以及高速视频显微镜检查来确定。研究人员在PCD患者和健康对照组中进行纤毛上皮细胞的纤毛发生实验，以提高PCD的诊断水平。结果：对所有患者进行了基因测序，发现了17个基因的变异，所有变异均为已知变异。使用高速视频显微镜比较PCD患者和健康对照组的CBF评估结果显示，PCD患者鼻部细胞的CBF显著降低（p < 0.0001），敏感性为91%，特异性为89.2%。CBF与年龄无关，成人与儿童之间无统计学差异。结论：通过包括ALI培养物CBF评估在内的多种诊断方法，所有患者的PCD诊断均得到确认。建立结合了基因型和结构异常的ALI培养物数据库，对于诊断以及未来作为靶向治疗开发和疗效评估的模型都是必要的。
研究背景与目的
原发性纤毛运动障碍（Primary Ciliary Dyskinesia, PCD）是一种由纤毛结构或功能缺陷导致的异质性常染色体隐性遗传病，其病理核心在于气道和窦腔纤毛的运动障碍，进而阻碍正常的黏液纤毛清除功能，引发一系列临床症状，如新生儿呼吸窘迫、慢性湿咳、支气管扩张、慢性鼻窦炎和中耳炎等。此外，由于精子鞭毛结构与运动纤毛相似，男性不育也是常见伴随现象。PCD的诊断极具挑战性，因其表型多样且与其他继发性纤毛运动障碍（由慢性炎症、感染或药物引起）难以区分。传统的诊断方法各有局限：透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）虽可鉴定纤毛轴丝的超微结构缺陷，但对某些基因型患者可能显示正常结构；而离体（ex vivo）检测纤毛摆动频率（Ciliary Beat Frequency, CBF）易受环境因素和继发性病变干扰。因此，开发更精准、稳定的诊断方法至关重要。气-液界面（Air-Liquid Interface, ALI）培养技术能够在体外诱导呼吸道上皮细胞分化形成功能性纤毛，从而排除体内炎症或感染的混杂影响，为PCD的功能诊断提供了更可靠的模型。本研究旨在整合遗传学、免疫荧光、TEM及ALI培养下的CBF评估等多种方法，系统性地提高PCD的诊断准确性，并探索建立结合基因型与结构异常的ALI培养物数据库的价值。
研究方法概述
研究人员从俄罗斯莫斯科地区招募了35例疑似PCD患者和10例健康对照（Healthy Controls, HC）。主要关键技术方法包括：1）分子遗传学分析：对所有患者进行全外显子组测序（Whole Exome Sequencing, WES），并通过Sanger测序验证致病性变异。2）ALI培养与纤毛发生：通过刷检活检获取鼻腔上皮细胞，经扩增后接种于Transwell小室，在ALI条件下培养24天诱导纤毛分化。3）高速视频显微镜（High-Speed Video Microscopy, HSVM）分析：使用自主研发的软件（PCD HSVMA）定量分析ALI培养物及离体标本的CBF。4）超微结构评估：采用TEM观察纤毛轴丝缺陷，并根据国际共识指南分为1类（确诊PCD）和2类（提示PCD）缺陷。5）免疫荧光（Immunofluorescence, IF）染色：对ALI培养物进行β-tubulin及特定蛋白标志物（如DNAH5、DNAH11、HYDIN、CFAP300）染色，以验证相应蛋白的定位与表达。
研究结果
遗传学分析结果：在所有35例患者中均建立了分子遗传学诊断，共发现17个基因的变异，包括16个常染色体隐性遗传基因（如DNAAF11, DNAH5, HYDIN, DNAH11等）和1个X连锁基因（OFD1）。其中，DNAH17基因变异的患者同时表现出典型的PCD相关轴丝超微结构缺陷，此前该基因仅被认为与孤立性男性不育相关，这一发现扩展了其表型谱。
TEM超微结构分析结果：根据国际共识标准，57%（20例）的患者检出1类缺陷（确诊PCD），20%（7例）检出2类缺陷，6%（2例）显示正常超微结构，另有17%（6例）未获得有效样本。
CBF功能评估结果：在ALI培养物中，PCD患者的CBF中位数显著低于健康对照组（3.62 Hz vs. 9.61 Hz, p < 0.0001）。ROC分析显示曲线下面积（AUC）高达0.989，表明CBF具有极佳的鉴别诊断效能。以6.02 Hz为截断值时，敏感性和特异性分别达到97.1%和100%。然而，若将截断值提高至9.4 Hz以实现100%敏感性，特异性则降至60%。值得注意的是，有两例PCD患者表现为僵硬的纤毛拍击模式（stiff beating pattern），其CBF处于正常范围，提示单纯依赖频率阈值无法完全排除诊断。此外，CBF在儿童与成人PCD患者间无显著统计学差异。
免疫荧光分析结果：与健康对照组相比，携带DNAH5, DNAH11, HYDIN, CFAP300基因致病性变异的PCD患者，其ALI培养物中对应蛋白的轴丝荧光信号显著减弱或缺失，证实了相应结构成分的丢失或错误定位。
讨论与结论
本研究表明，ALI培养结合HSVM进行CBF评估是一种稳健的PCD诊断工具，能够有效区分患者与健康个体。该方法的主要优势在于排除了继发性纤毛运动障碍的干扰，但其局限性在于不能单独作为排除性诊断，必须结合拍击模式、超微结构和基因型进行综合判读。研究强调，TEM和分子遗传学仍是PCD诊断的核心方法，而CBF评估、免疫荧光及一氧化氮（Nitric Oxide, NO）检测可作为补充手段。尽管ALI培养耗时耗力，但其建立的标准化培养物库对于深入理解纤毛功能、开发靶向疗法及评估疗效具有重要价值。
研究结论：在ALI培养物中分析CBF比离体方法更为准确。此外，建立结合了基因型和结构异常的ALI培养物数据库，对于诊断以及未来作为靶向治疗开发和疗效评估的模型都是必要的。
