《Fermentation》：Proteolytic and Functional Changes During Whey Fermentation by Lactococcus lactis NCFB 724: An Integrated Analysis of ACE and DPP-IV Inhibitory Activities
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从食品蛋白质中衍生的生物活性肽作为潜在的功能性食品组分已受到关注。本研究评估了利用乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NCFB 724发酵乳清过程中的蛋白水解与功能性变化，重点关注其对血管紧张素转化酶（angiotensin-converting
从食品蛋白质中衍生的生物活性肽作为潜在的功能性食品组分已受到关注。本研究评估了利用乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NCFB 724发酵乳清过程中的蛋白水解与功能性变化，重点关注其对血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）和二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV）的体外抑制作用。研究人员将乳清发酵48小时，监测微生物生长、pH值、可滴定酸度、游离氨基浓度、电泳图谱以及ACE和DPP-IV抑制活性，并额外进行了皮尔逊相关性分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）作为探索性方法。发酵期间，pH值从6.07降至4.00，细胞活力从5.9增至8.8 log CFU/mL，游离氨基浓度从407.02增至539.20 μg/mL。电泳分析显示低分子量区域（<10 kDa）的信号分布发生变化。DPP-IV抑制活性在不同发酵时间点间无显著差异，0小时为35.49%，48小时为37.80%；而ACE抑制活性表现出时间依赖性响应，在24小时达到最高值（57.14%）。前两个主成分解释了总方差的82.69%，为各评估变量之间的时间模式提供了探索性可视化。总体而言，更高的蛋白水解程度并未对应更高的酶抑制活性。这些发现确定24小时是一个值得进一步表征的发酵阶段。
研究背景与问题
近年来，代谢疾病如2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）及其并发症高血压的发病率在全球范围内持续上升，对公共健康构成重大挑战。因此，能够辅助管理代谢紊乱的膳食策略日益受到关注，其中功能性食品成为有前景的非传染性疾病管理替代方案。乳清作为奶酪生产过程中的重要副产品，富含营养物质，但其大量排放也造成了严重的环境污染和富营养化问题。将乳清转化为高附加值成分或产品具有重要的技术和环境意义。乳清是生物活性肽前体的优质来源，这些肽具有抗高血压、抗糖尿病、抗氧化等多种生物效应，其活性受氨基酸组成、序列和分子大小等结构特征影响。利用乳酸菌进行发酵是一种释放生物活性肽的有效策略，因其不仅能改变基质理化特性和感官品质，还能促进有益健康肽的生成。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NCFB 724广泛应用于乳制品工业，具有酸化、产香及产生细菌素、乳酸、γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）等代谢物的能力。然而，尽管该菌株在乳制品发酵中应用广泛，但以乳清为底物、利用该菌株生产生物活性肽的研究仍相对不足，现有应用多集中于技术性代谢产物的生产。因此，本研究旨在通过皮尔逊相关性分析和主成分分析（PCA），探索利用L. lactis NCFB 724发酵乳清过程中，理化、微生物、蛋白水解与功能性反应之间的联系。
研究方法概述
研究人员采用的主要关键技术方法包括：利用热处理的10%（w/v）乳清溶液作为发酵培养基，接种经乳清驯化的L. lactis NCFB 724种子液，于37℃发酵48小时，定期取样监测微生物生长、pH值和可滴定酸度；通过2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）法测定游离氨基浓度以评估蛋白水解程度；采用三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tris-Glycine-SDS-PAGE）分析蛋白质和低分子量组分的电泳图谱变化；利用分光光度法分别测定发酵上清液的血管紧张素转化酶（ACE）和二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制活性；最后运用皮尔逊相关性分析和主成分分析（PCA）进行多变量数据探索。
研究结果
3.1 L. lactis NCFB 724在发酵过程中的生长
通过平板计数法监测微生物生长动力学，结果显示在6至24小时之间观察到指数生长期，细胞活力逐渐增加至约8.3 log CFU/mL。此后培养物进入稳定期并维持至48小时，表明乳清体系为该菌株的生长和维持提供了适宜条件。
3.2 发酵过程中pH值与可滴定酸度的变化
通过电位计和酸碱滴定法检测，发现pH值在整个发酵过程中持续下降，可滴定酸度（以乳酸g/L计）相应升高。这些变化在前24小时内最为显著，与L. lactis NCFB 724的指数生长期相吻合。之后随着培养物进入稳定期，酸化速率减缓。
3.3 蛋白水解谱评估
3.3.1 游离氨基的测定
采用TNBS法测定游离氨基浓度，结果显示其从0小时的407.02 μg/mL逐步增加至48小时的539.19 μg/mL，表明发酵过程中持续的蛋白水解作用。但仅48小时的值与早期时间点相比具有统计学显著性差异（p < 0.05）。
3.3.2 电泳图谱（Tris-Glycine-SDS-PAGE）
通过Tris-Glycine-SDS-PAGE分析，发现初始阶段存在对应于β-乳球蛋白（β-LG）和α-乳白蛋白（α-LA）等主要乳清蛋白的清晰条带。随着发酵进行，这些条带强度减弱，同时低分子量区域（<10 kDa）的电泳信号强度增加，表明发生了蛋白水解转化。
3.4 DPP-IV抑制活性评估
通过分光光度法评估DPP-IV抑制活性，发现其在整个发酵过程中保持相对稳定，数值介于35.49%至37.80%之间，不同时间点间无显著差异（p > 0.05）。尽管蛋白水解程度加深，但DPP-IV抑制活性并未随之成比例增加。
3.5 ACE抑制活性评估
通过分光光度法评估ACE抑制活性，发现其呈现非线性的时间依赖模式。0小时抑制率为43.57%，12小时显著下降至35.71%（p < 0.05），随后在24小时达到最高值57.14%（p < 0.05），之后在36小时和48小时又有所回落。最高抑制活性出现在24小时，而非发酵终点。
3.6 发酵相关变化的多变量分析
3.6.1 皮尔逊相关性分析
皮尔逊相关性分析显示，发酵时间与游离氨基浓度（r = 0.94）、细胞活力（r = 0.89）和可滴定酸度（r = 0.97）呈强正相关，与pH值呈强负相关（r = -0.99）。而ACE和DPP-IV抑制活性与发酵时间或游离氨基浓度均未显示出显著的线性相关性。
3.6.2 主成分分析（PCA）
PCA作为一种探索性可视化方法，前两个主成分解释了总方差的82.69%。PC1主要由pH值、可滴定酸度、游离氨基浓度和细胞活力贡献，反映了与发酵进程相关的理化、微生物和蛋白水解变化。而DPP-IV和ACE抑制活性主要贡献于PC2，表明其变异模式独立于发酵的一般进程。
总结与讨论
本研究表明，利用L. lactis NCFB 724发酵乳清48小时，伴随着渐进的理化、微生物和蛋白水解变化。游离氨基的增加和电泳图谱的变化证实了持续的蛋白水解作用，并在低分子量区域观察到信号分布的改变。发酵上清液在实验条件下展现出ACE和DPP-IV抑制活性，但两者遵循不同的时间模式：ACE抑制活性在24小时达到峰值，而DPP-IV抑制活性并未随蛋白水解程度的加深而成比例增加。这表明蛋白水解本身并不能完全解释所观察到的酶抑制效应。探索性的皮尔逊相关性和PCA分析为各变量间的关系和时间模式提供了描述性可视化，但其解释受限于较少的观测时间点。此外，由于未鉴定单个肽段序列且抑制活性测定直接在发酵上清液中进行，观察到的ACE和DPP-IV抑制活性不能直接归因于特定的生物活性肽。这些发现确定了24小时是一个值得进一步研究的发酵阶段。
研究结论翻译
利用L. lactis NCFB 724发酵乳清在48小时内伴随着渐进的理化、微生物和蛋白水解变化。游离氨基的增加和电泳图谱的变化与持续的蛋白水解一致，同时在低分子量区域也观察到信号分布的改变。然而，这些电泳变化不应被解释为特定肽组分的鉴定或定量测定。在所用实验条件下，发酵上清液表现出ACE和DPP-IV抑制活性，但两种抑制响应遵循不同的时间模式。在此条件下，ACE抑制在24小时达到峰值，将该发酵阶段确定为值得进一步表征的时间点，而DPP-IV抑制并未随蛋白水解成比例增加。这些发现表明，仅凭蛋白水解无法解释所观察到的酶抑制响应。探索性的皮尔逊相关性和PCA分析为各评估变量之间的关系和时间模式提供了描述性可视化；然而，其解释受限于较少的发酵阶段观测次数。此外，由于未鉴定单个肽段序列且抑制活性测定直接在发酵上清液中进行，观察到的ACE和DPP-IV抑制活性不能具体归因于明确的生物活性肽。需要进一步的组分分离与化合物表征、肽段鉴定、浓度-响应分析、IC50测定以及适当的阳性对照研究，以确定负责所观察抑制活性的化合物并建立其抑制效力。
