富含黏液的环境影响了铜绿假单胞菌的细胞毒性以及噬菌体介导的上皮细胞保护作用

《iScience》：Mucin-rich environment shapes Pseudomonas aeruginosa cytotoxicity and phage-mediated epithelial protection

　　亮点
• 黏蛋白增加了上皮细胞对铜绿假单胞菌细胞毒性的敏感性
• 黏蛋白减少了铜绿假单胞菌在上皮细胞中的内化
• 黏蛋白增强了噬菌体介导的上皮细胞保护作用
• 黏蛋白改变了耐噬菌体铜绿假单胞菌的表型特征

摘要
慢性呼吸系统疾病（CRDs）的特点是黏蛋白过度积累，这改变了气道上皮中的宿主-病原体相互作用。尽管噬菌体疗法越来越多地被视为抗生素的替代方案，但黏蛋白丰富环境如何影响细菌毒力和噬菌体效果仍不清楚。在这里，我们展示了外源性黏蛋白如何改变铜绿假单胞菌在上皮细胞中的表现。黏蛋白暴露诱导了转录变化，增加了上皮细胞对细菌细胞毒性的敏感性，并减少了细菌的黏附和内化。令人惊讶的是，黏蛋白同时增强了噬菌体介导的保护作用，保护了上皮细胞的存活而不妨碍噬菌体的复制。此外，长期暴露于黏蛋白中会增强无细胞分泌体的细胞毒性，并改变耐噬菌体细菌的表型和基因型特征。这些发现共同表明，黏蛋白丰富的环境在感染动态中产生了相反的效果：既增加了宿主的脆弱性，又增强了噬菌体对细菌感染的控制。我们的结果强调了黏膜环境作为噬菌体疗法效果和细菌适应性的关键决定因素。

图形摘要

引言
慢性呼吸系统疾病（CRDs），包括囊性纤维化（CF）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）和哮喘，其特征是持续的黏蛋白分泌，这会影响气道上皮中的黏液纤毛清除功能以及反复发生的气道感染。这些疾病的标志之一是黏蛋白（如MUC5AC和MUC5B）的过度分泌，这些黏蛋白形成凝胶状结构，捕获病原体并帮助维持上皮完整性。杯状细胞的黏蛋白分泌量受多种因素的影响，如病原体、炎症反应和外来物质暴露。黏蛋白的过度分泌会改变气道表面的物理和生化特性， creating 一个黏稠、缺氧和氧化应激的微环境，从而破坏免疫平衡并促进微生物定植。铜绿假单胞菌是一种常见的机会性病原体，在缺氧条件下繁殖旺盛。它通过发展抗菌素抗性、形成生物膜以及通过群体感应（QS）调节的毒力因子的分泌来导致上皮损伤和肺功能下降。黏膜环境直接影响铜绿假单胞菌的行为。例如，已经证明黏蛋白糖链可以通过破坏群体感应信号传导和抑制生物膜形成来减弱其毒性。此外，黏蛋白的高浓度还会促进细菌聚集，增加细菌对抗生素的耐受性。除了影响微生物行为外，黏蛋白还与上皮免疫反应密切相关，尤其是通过调节关键的促炎细胞因子。促炎细胞因子（如白细胞介素6 (IL-6) 和 IL-8 (或 CXCL8) 在 CRDs 中起核心作用，并与黏蛋白过度分泌相关。IL-8 在响应细菌毒力和上皮应激时由病原体相关分子模式 (PAMPs) 诱导，作为中性粒细胞的化学诱饵，导致持续的炎症和组织损伤。IL-6 则是一种多效细胞因子，在急性期反应中上调，通常在炎症信号和 PAMPs 识别后上调。IL-6 和 IL-8 水平的升高与慢性气道疾病患者的疾病严重程度、频繁急性加重和肺功能快速下降有关。

黏蛋白的双重效应突显了我们在理解其對细菌感染结果和治疗影响方面的关键空白。特别是，关于黏蛋白丰富环境如何调节噬菌体、细菌和上皮细胞之间相互作用的作用仍大多不明确。噬菌体疗法由于具有特异性、自我复制能力以及对共生微生物群的影响较小而被认为是一种有前景的方法来对抗多重耐药细菌。然而，将噬菌体应用于黏液密集的组织面临独特的挑战，包括扩散受限、受体可及性改变和潜在的免疫干扰。某些研究提出“噬菌体黏附于黏液”（BAM）模型，认为噬菌体结合黏蛋白糖链，增加其在黏膜表面的浓度，从而增强病原体的清除作用；而另一些研究则认为黏蛋白可能作为物理屏障，阻碍噬菌体的扩散及其到达细菌宿主的能力。在其他细菌模型（如柱状黄杆菌）中，黏蛋白已被证明可以触发细菌的保护性应激反应或增强适应性机制（如 CRISPR-Cas 免疫）。这些对比发现强调了不同生物系统中黏蛋白-噬菌体-细菌相互作用的复杂性。因此，黏蛋白的影响高度依赖于具体情境，受黏蛋白类型、微生物行为和感染动态的影响。此外，关于黏蛋白如何在噬菌体压力下影响细菌进化知之甚少。噬菌体抗性通常会导致宿主细菌的适应性成本或权衡，例如运动能力改变、表面修饰或毒力降低。目前尚不清楚黏蛋白是减轻还是加剧这些权衡，以及它们如何影响耐噬菌体菌群的表型和基因型特征。

在这项研究中，我们使用细胞培养模型来探讨黏蛋白丰富的微环境如何调节上皮反应、铜绿假单胞菌的细胞毒性、噬菌体介导的上皮损伤减少以及耐噬菌体的表型特征。我们发现黏蛋白暴露诱导了与 CRD 相关的上皮细胞转录变化，增强了细菌的细胞毒性并促进了炎症，同时选择性地抑制了细菌的毒力途径。尽管如此，黏蛋白增强了噬菌体 DMS3 对上皮细胞的保护作用，且这种保护作用依赖于细菌负荷，而不会引发抗病毒免疫反应。此外，黏蛋白还改变了耐噬菌体铜绿假单胞菌的表型和遗传特征，影响了其毒力特征和抗性之间的权衡。这些发现为了解黏蛋白丰富条件下上皮细胞、细菌和噬菌体之间的三方相互作用提供了新的见解，对优化黏膜环境中的噬菌体疗法具有重要意义。

结果
黏蛋白富集特征包括气道上皮细胞中的 CRD 相关转录重塑
黏液过度分泌是慢性呼吸系统疾病（如 COPD 和 CF）的标志。为了探究黏蛋白丰富的微环境如何影响上皮基因表达，我们对暴露于 0.2% 黏蛋白 18 小时的 A549 气道上皮细胞进行了 RNA 测序。主成分分析 (PCA) 显示组内聚类一致，对照组和黏蛋白暴露组之间有明显的分离，表明发生了转录组变化（图 1A）。差异表达分析鉴定出 179 个上调基因和 102 个下调基因（log2 倍变化 [FC] > 0.5），更严格的筛选标准进一步确定了 38 个上调基因和 23 个下调基因（log2FC > 1）（图 1B）。黏蛋白丰富的环境诱导了与细胞应激和炎症（如对缺氧和氧化应激的反应）、葡萄糖代谢转变（如糖酵解和糖异生）、上皮重塑（如细胞黏附、连接维持和上皮-间充质转化）以及生长因子信号传导（如 TGF-β 和成纤维细胞生长因子 [FGF]）相关的基因调控（图 1C 和 S1）。

图 1 曝露于黏蛋白丰富环境的 A549 细胞的转录组分析
(A) 用 0.2% 黏蛋白或 контроль培养基孵育 18 小时的 A549 细胞的全基因表达主成分分析 (PCA)（每组 n = 3）。每个点代表一个生物学重复实验。
(B) 黏蛋白处理组和对照组细胞之间差异基因表达的火山图。log2 倍变化（x 轴）与 ?log10 假发现率 (FDR) 调整后的 p 值（y 轴）相对应。显著调控的基因定义为 FDR > 0.5，且 log2 倍变化 > 1（上调，红色）或 > ?1（下调，蓝色）。
(C) 上调（红色）和下调（蓝色）基因的生物学过程富集的基因本体 (GO) 分析。条形图表示按富集倍数排序的显著富集的生物学过程，颜色强度对应统计显著性（–log10 FDR）。

这些转录变化与慢性肺疾病中常见的基因表达特征一致，提供了一个生理相关的平台，用于研究黏膜条件下的上皮反应和上皮-病原体相互作用。

黏蛋白丰富的环境增强了铜绿假单胞菌的细胞毒性和上皮炎症反应
为了探究黏蛋白丰富的环境如何改变细菌的细胞毒性，我们评估了用 PA14 和 573 菌株感染 A549 细胞后的上皮细胞存活情况。PA14 在 10^4 匍生单位 (CFUs) 时表现出显著的细胞毒性，而 573 菌株则需要更高的接种量（10^6 CFUs）才能产生类似的效果（图 2A）。用 0.2% 黏蛋白预处理 A549 细胞显著增强了两种菌株在感染后 4 小时内的细胞毒性，表明黏蛋白富集使上皮细胞对细菌攻击更加敏感（图 2B）。这种效应与黏蛋白的暴露时间无关，无论是预培养还是共培养都导致了类似的上皮细胞死亡增加（图 S2A）。在 HT-29 肠上皮细胞中也观察到了类似的趋势，黏蛋白暴露增加了对 PA14 诱导的细胞毒性的敏感性（图 2C），这表明这种现象不仅限于气道上皮细胞。值得注意的是，猪胃黏蛋白 (PGM) 单独使用对这两种细胞系均无明显的细胞毒性作用，这强调了它在调节上皮-细菌相互作用中的作用，而不是降低细胞存活。为了探究潜在机制，我们评估了黏蛋白对细菌生长的影响。铜绿假单胞菌 PA14 在 DMEM 中与 0.2% 黏蛋白一起在 37°C 下孵育 5 小时后，通过计数活菌进行定量。细菌计数增加了，且与黏蛋白无关（图 2D），表明细胞毒性的增加与黏蛋白对细菌生长的影响无关。接下来，我们研究了黏蛋白是否影响细菌进入上皮细胞。令人惊讶的是，用 0.2% 黏蛋白预处理 A549 细胞显著减少了铜绿假单胞菌在 A549 和 HT-29 细胞中的内化（图 2E 和 2F）。此外，黏蛋白对细菌内化的效应与上皮细胞中铜绿假单胞菌 PA14 的减少相关（图 2G）。这些结果表明，黏蛋白限制了细菌对上皮表面的黏附，揭示了细胞毒性和细菌内化之间的反比关系。为了确定细胞外细菌产物是否参与了细胞毒性的增加，我们将 A549 细胞暴露于在 0.2% 黏蛋白存在下 PA14 孵育后收集的无细胞分泌体 5 小时（图 2H）。在无黏蛋白条件下生成或在 6 小时后收集的分泌体没有细胞毒性。相反，在 24 小时后在黏蛋白存在下收集的分泌体显著增加了上皮细胞死亡，表明黏蛋白促进了长时间细菌生长过程中细胞外毒力因子的分泌或积累。接下来，我们研究了黏蛋白丰富条件是否影响 IL-6 和 IL-8 的表达，这两种细胞因子在 CRDs 中通常会上升。PA14 和 573 菌株在 4 小时后均触发了 IL-8 和 IL-6 的表达，而 0.2% 黏蛋白在黏蛋白丰富条件下进一步放大了这种反应，但单独的黏蛋白并未诱导细胞因子表达（图 2I、2J 和 S2B），表明炎症放大依赖于细菌感染。我们在 HT-29 细胞中也观察到了类似的趋势，其中黏蛋白暴露增强了 PA14 感染期间的 IL-8 表达（图 2K）。然而，在所有测试条件下，HT-29 细胞中的 IL-6 表达均无法检测到，这与先前的研究结果一致。

图 2 黏蛋白富集增加了铜绿假单胞菌的细胞毒性并增强了上皮炎症反应，同时减少了细菌内化
(A) 在 A549 细胞上，分别用 PA14 和 573 菌株感染 4 小时的细菌细胞毒性（n = 3）。
(B) 在用 0.2% 黏蛋白预处理 18 小时后再用 PA14 或 573 感染 A549 细胞的细菌细胞毒性（1 × 10^5 CFU）。
(C) 在用 0.2% 黏蛋白预处理 HT-29 细胞 1 小时后再用 PA14 感染（1 × 10^5 CFU）的细菌细胞毒性。20% DMSO 作为细胞毒性的阳性对照。
(D) 在 37°C 下，用 0.2% 黏蛋白在 DMEM 中培养 5 小时的 PA14 细胞的 CFU 计数。
(E) 在用 0.2% 黏蛋白预处理 1 小时后再用 PA14 或 573 感染（1 × 10^5 CFU）的 A549 细胞中的细菌内化。
(F) 在用 0.2% 黏蛋白预处理 1 小时后再用 PA14 感染（1 × 10^5 CFU）的 HT-29 细胞中的细菌内化。
(G) 在用 0.2% 黏蛋白预处理 1 小时后再用 PA14 感染（1 × 10^5 CFU）的 A549 细胞上的细菌黏附。
(H) 在 37°C 下，用 0.2% 黏蛋白在 DMEM 中培养 6 或 24 小时的 PA14（1 × 10^5 CFU）收集的无细胞分泌体处理 5 小时的 A549 细胞的细胞毒性。
(I 和 J) 在用 0.2% 黏蛋白预处理并感染 PA14 或 573（1 × 10^5 CFU）4 小时的 A549 细胞中的相对 IL-8 (I) 和 IL-6 (J) mRNA 水平。
(K) 在用 0.2% 黏蛋白预处理并感染 PA14（1 × 10^5 CFU）4 小时的 HT-29 细胞中的 IL-8 mRNA 表达。细胞用 100 μg/mL TNF 作为阳性对照。

定量数据代表指定生物学重复实验的平均值 ± 标准误 (SEM)。统计比较使用双向 ANOVA 和多重比较以及 Sidak 的事后检验 (A–E 和 H–J) 和非配对双尾 t 检验 (F 和 G) 进行；p 值和重复次数已标明。模拟数据为无细菌对照。另见图S2。总体而言，这些结果表明，富含粘蛋白的环境会增强上皮细胞对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的易感性，从而放大细胞毒性和炎症反应，尽管这种环境降低了细菌的生长、黏附和侵袭能力。此外，细菌的细胞外因子也参与了这一表型特征的形成，尽管直接细菌-上皮细胞的相互作用可能也是感染过程中观察到的快速上皮细胞损伤的原因。

粘蛋白富集的环境增强了DMS3vir噬菌体对上皮细胞的保护作用。为了评估DMS3vir在模拟上皮感染条件下的抗菌活性，我们将铜绿假单胞菌PA14培养在含有不同DMS3vir感染复数（MOIs）的DMEM培养基中。正如预期的那样，DMS3vir以浓度依赖的方式抑制了PA14的生长，较高的MOIs产生了更持久的细菌抑制效果（图3A）。然而，在用MOI为1和10处理的培养物中，大约18小时后细菌重新开始生长，这与长时间培养过程中出现噬菌体不敏感的细菌群体相符。接下来，我们研究了粘蛋白是否干扰噬菌体的复制。与仅含噬菌体的对照组相比，与PA14共同培养5小时后，DMS3vir的噬菌斑计数显著增加，证实了噬菌体的活跃复制（图3B）。重要的是，在所测试的两种MOI下，0.2%的粘蛋白存在并没有影响噬菌体的滴度，表明在实验条件下粘蛋白不会损害DMS3vir的复制能力。随后，我们评估了粘蛋白是否影响噬菌体对上皮细胞的保护作用。我们在铜绿假单胞菌PA14感染前，先让A549细胞暴露于0.2%的粘蛋白和DMS3vir。4小时后，噬菌体的预处理逆转了粘蛋白增强的细胞毒性，使上皮细胞的存活率恢复到与无粘蛋白条件相似的水平（图3C）。噬菌体滴度测定证实，DMS3vir在细菌存在的情况下能够有效复制，并且粘蛋白没有改变其复制能力（图3D）。24小时的延长培养表明，无论是否暴露于粘蛋白或初始细菌负荷如何，噬菌体的复制能力保持稳定（图3E和3F）。有趣的是，24小时的共培养显示，粘蛋白增强噬菌体DMS3vir对上皮细胞的保护作用依赖于初始细菌接种量。在较高细菌密度（10^5 CFU）下，噬菌体单独作用的效果有限，但与粘蛋白结合后可以适度改善上皮细胞的存活率（图3G）。在较低细菌接种量（10^2–10^3 CFU）下，噬菌体和粘蛋白共同作用增强了上皮细胞的存活率（图3H和3I），表明噬菌体对上皮细胞的保护作用存在阈值依赖性。

图3 粘蛋白富集环境增强了噬菌体DMS3vir对铜绿假单胞菌感染的保护作用

图注：
(A) 在含有不同感染复数（MOIs）的DMEM培养基中培养的铜绿假单胞菌PA14（1 × 10^5 CFU）的生长曲线（n = 4）。(*）表示在8小时时组间或每组内18至24小时之间的p值 < 0.0001。
(B) 与PA14（1 × 10^5 CFU）共同培养5小时后DMS3vir噬菌体的PFU计数（n = 5）。
(C) 在与DMS3vir和粘蛋白共同预处理18小时后，A549细胞被铜绿假单胞菌PA14（1 × 10^5 CFU）感染4小时后的细胞毒性。
(D) 同一实验中培养上清液的DMS3vir定量，在感染4小时后采集。
(E和F) 在感染前分别暴露于0.2%粘蛋白和DMS3vir 1 × 10^6 PFU或1 × 10^7 PFU的A549细胞培养上清液的噬菌体定量，初始细菌负荷不同（F）。
(G–I) 在不同初始细菌浓度（1 × 10^5 CFU、1 × 10^3 CFU或1 × 10^2 CFU）下，与DMS3vir和粘蛋白共同预处理18小时后，A549细胞被铜绿假单胞菌PA14感染24小时后的细胞毒性。

我们进一步研究了噬菌体处理是否影响粘蛋白富集条件下的上皮细胞炎症反应。如前所述，粘蛋白在PA14感染期间会增强IL6和IL8的表达（图4A和4B）。有趣的是，无论是否存在粘蛋白，DMS3vir的孵育都能降低IL8的表达，而IL6的表现则未受影响。此外，噬菌体暴露并未触发抗病毒信号通路，因为IFNB水平保持稳定（图S2C），且在测试的实验条件下无法检测到IFNL1转录本。

这些结果表明，富含粘蛋白的微环境增强了DMS3vir噬菌体对上皮细胞的保护效果，同时不损害其复制能力，尤其是在生理相关的细菌密度下。此外，DMS3vir表现出选择性的免疫调节作用，同时避免了抗病毒反应，这突显了其与黏膜组织的兼容性。

为了研究粘蛋白富集环境是否影响噬菌体抗性的发展，我们在铜绿假单胞菌PA14感染前，将A549细胞与0.2%的粘蛋白和DMS3vir噬菌体共同孵育18小时。24小时细菌暴露后，我们分离出了六个独立的噬菌体不敏感突变体（BIMs）：三个来自标准条件（BIM1–3），三个来自粘蛋白富集条件（BIM(M)1–3），以及三个对照菌株（未暴露于噬菌体），包括PA14(WT)（原始菌株）、PA14(C)（暴露于A549的菌株）和PA14(M)（暴露于A549 + 粘蛋白的菌株）。对照菌株保持了其特有的光滑、黏液状和黄绿色的菌落形态（图5A和S3A）。相比之下，BIM克隆形成了小而粗糙的菌落，具有增强的绿色色素沉着，表明产生了更多的绿脓素（图5B和S3A）。BIM(M)菌株表现出介于粗糙和光滑菌落之间的形态，带有黄绿色色素沉着，尽管BIM(M)1菌株仍保持粗糙形态（图5C和S3A）。暴露于DMS3vir噬菌体的菌株证实了BIM和BIM(M)克隆的细菌抗性（图S3B–S3D）。全基因组测序显示，抗性可能与毒力、运动性和附着性相关的基因发生了突变，而CRISPR分析未发现新的间隔序列获得，表明抗性可能是由于表面修饰所致（图S4A–S4C）。

表型分析表明，粘蛋白富集环境影响了噬菌体抗性铜绿假单胞菌突变体的特性。6小时后，BIM(M)菌株产生的绿脓素水平与对照组相当，而BIM菌株则产生了较少的绿脓素（图5D）。48小时后，BIM菌株产生的绿脓素水平增加，而BIM(M)和对照菌株则减少了绿脓素的产生（图5E）。尽管存在这些差异，两个噬菌体抗性组形成的生物膜都比对照组弱（图5F），表明生物膜形成的减弱是抗性的共同代价。运动性测试进一步区分了这些组别：所有BIM和BIM(M)菌株都失去了鞭毛依赖的运动性（图5G）。此外，BIM(M)2和BIM(M)3保留了部分群集运动性（依赖鞭毛的运动性），而BIM菌株和BIM(M)1则失去了运动性（图5H）。这种群集行为与细菌的内化能力相关，所有BIM菌株和BIM(M)1都表现出进入上皮细胞的能力减弱，而BIM(M)2和BIM(M)3则保持了部分进入能力（图5I）。细胞存活率测试确认，所有噬菌体抗性克隆在感染后4小时和8小时内的细胞毒性均低于对照组（图5J和5K）。

综上所述，这些结果表明，富含粘蛋白的微环境不会阻止噬菌体抗性的出现，但会影响抗性菌株的表型和基因型特征。BIM(M)菌株保持了绿脓素水平，并部分保留了群集运动性和内化能力，同时降低了细胞毒性、生物膜形成能力以及鞭毛运动性。这些发现强调了黏膜环境、细菌适应性和噬菌体介导的选择之间的复杂相互作用，并突显了上皮来源因素在塑造噬菌体治疗相关进化结果中的重要性。

讨论：
慢性阻塞性肺病（CRDs）和囊性纤维化（CF）等疾病的特征是粘蛋白过度积累，这严重改变了气道微环境和宿主-病原体相互作用。在这项研究中，我们展示了富含粘蛋白的环境通过对抗上皮细胞敏感性和噬菌体介导的控制作用来重塑铜绿假单胞菌感染的过程。具体来说，粘蛋白暴露导致上皮细胞发生转录变化，这些变化与炎症和应激相关通路一致，增加了上皮细胞对铜绿假单胞菌的易感性，尽管减少了细菌的黏附和内化；同时，在长时间培养后促进了细菌细胞外细胞毒因子的积累，并增强了噬菌体DMS3vir的保护作用，而不损害噬菌体的复制能力。此外，粘蛋白还影响了噬菌体暴露后恢复的噬菌体抗性菌株的表型特征。这些发现表明，粘蛋白是决定细菌致病性和噬菌体治疗效果的关键环境因素。

首先，我们探讨了外源粘蛋白如何影响上皮细胞。我们的转录组分析表明，外源粘蛋白的暴露足以在上皮细胞中诱导出与CRDs中观察到的基因表达模式一致的基因表达模式，这些变化涉及缺氧、氧化应激、代谢重编程和上皮重塑等途径。这些变化表明，富含粘蛋白的环境不仅可能作为物理屏障，还可能主动调节上皮细胞的反应。粘蛋白可能不仅仅作为黏液的被动成分，而是通过改变随后细菌感染过程中的反应来影响上皮细胞的应答。接下来，我们研究了粘蛋白对细菌和上皮细胞相互作用的影响。令人惊讶的是，粘蛋白暴露增加了上皮细胞对铜绿假单胞菌的易感性，同时减少了细菌的黏附和内化。这种现象无法用细菌入侵增强或早期细菌增殖增加来解释，因为在用于感染测定的早期培养期间，粘蛋白并未改变铜绿假单胞菌的生长。相反，上皮细胞暴露于在粘蛋白存在下长期细菌生长产生的无细菌分泌组会增强诱导显著上皮细胞毒性的细胞外因子。综上所述，这些发现表明，上皮细胞的损伤主要是由改变的细胞外细菌活动引起的，而非细菌进入宿主细胞的增加。一种可能的解释是，可溶性粘蛋白与膜相关的粘蛋白（如MUC1）竞争细菌结合位点。MUC1与铜绿假单胞菌的鞭毛蛋白相互作用，促进细菌黏附到上皮表面。因此，过多的细胞外粘蛋白可能通过掩盖上皮结合位点来减少细菌的黏附，同时延长细菌在富含粘蛋白的环境中的停留时间，有利于细胞外毒力因子的积累或活性。尽管具体的细胞外因子尚未确定，但我们的发现表明，分泌的细菌产物导致了上皮细胞的损伤。因为在6小时后产生的分泌组不具有细胞毒性，而直接的细菌感染在同一时期引起了上皮细胞的损伤，所以直接的细菌-上皮细胞相互作用也可能参与了感染的早期阶段。此外，粘蛋白介导的细菌行为变化，包括鞭毛运动性和聚集性的变化，可能进一步影响了细菌接触上皮细胞的能力，这与先前在粘蛋白环境中发现的聚集介导的耐受性有关。另外，粘蛋白诱导的上皮细胞应激反应可能使宿主细胞对细菌产物更加敏感，从而在不增加细菌进入的情况下放大细胞毒性效应。这些解释与观察到的促炎细胞因子表达增加一致，特别是IL-6和IL-8，在黏膜感染期间尤为常见。IL-8的增加可能会放大中性粒细胞的招募并导致组织损伤，从而加剧炎症和上皮重塑的不良循环。这些发现共同支持了一个模型，即富含黏蛋白的环境增强了上皮细胞对细菌因子的反应性，而不是促进细胞内感染。值得注意的是，黏蛋白还增强了噬菌体治疗减少上皮细胞毒性的能力。尽管黏蛋白不会影响DMS3vir在细菌培养物中的扩增或溶菌活性，但其存在改善了上皮细胞对细菌感染的防护，尤其是在细菌密度较低的情况下。一个可能的解释是黏蛋白改变了细菌和噬菌体的空间排列，增加了它们有效接触的机会。这一解释与BAM模型一致，该模型认为噬菌体结合黏蛋白糖并结合在黏膜表面，从而增强了它们控制细菌种群的能力。尽管我们没有直接测量噬菌体-黏蛋白的相互作用，但在富含黏蛋白的条件下观察到的增强保护效果支持了黏液可以在复杂生物环境中促进噬菌体活性的观点。在这方面，黏膜环境可能被用来增强基于噬菌体的干预措施，最近在囊性纤维化患者中的吸入噬菌体研究也报告了铜绿假单胞菌负担的减少且没有不良事件。噬菌体DMS3vir进一步调节了铜绿假单胞菌感染期间的上皮免疫反应，通过减少IL-8的表达而不影响IL-6或诱导抗病毒信号通路。由于DMS3vir单独使用或与黏蛋白联合使用时都没有改变细胞因子的表达，因此IL-8的优先减少可能反映了噬菌体介导的细菌裂解后细菌刺激的减少，而不是选择性地针对上皮信号通路。IL-8是主要的中性粒细胞趋化因子，其过度产生会导致慢性呼吸道疾病中的持续中性粒细胞炎症和进行性组织损伤。因此，减少IL-8的表达可能代表噬菌体治疗的额外治疗益处，因为它能够在保留抗菌活性的同时限制过度的炎症反应。相比之下，IL-6受多种炎症和应激相关途径的调节，因此在感染早期阶段可能对活细菌数量的减少不太敏感。此外，没有检测到I型或III型干扰素反应，表明DMS3vir噬菌体不会在上皮细胞中触发可测量的抗病毒反应，这支持了噬菌体疗法与黏膜组织的兼容性。我们的结果还表明，黏蛋白暴露会影响噬菌体抗性的铜绿假单胞菌的表型特征。尽管在两种条件下都出现了抗性，但暴露于黏蛋白的菌株表现出不同的表型和基因型特征，包括色素沉着、运动能力和内化能力的差异，这突显了黏蛋白在塑造抗性轨迹中的作用。缺乏CRISPR间隔区的获得支持了表面修饰作为噬菌体抗性的主要机制。所有抗性克隆中都观察到了IV型菌毛介导的抽动运动的丧失，表明菌毛功能是抗性进化中的一个常见且高成本的目标。这种表型与IV型菌毛作为DMS3vir噬菌体主要受体的一致，表明抗性是通过受体修饰产生的。然而，菌毛破坏的适应性成本超出了噬菌体抗性的范围，因为抽动运动对于早期表面定植、微菌落扩展和生物膜形成是必需的。相比之下，BIM菌株和BIM(M)1中的鞭毛依赖性群集运动完全丧失，而在BIM(M)2–3分离株中仅部分受损。这种差异表明，富含黏蛋白的环境可能缓冲了一些与抗性相关的多效成本，并在选择压力下保留了鞭毛功能。由于铜绿假单胞菌鞭毛蛋白与呼吸道上皮细胞上的MUC1相互作用，保留鞭毛对细菌附着和细胞摄取有直接影响。因此，BIM(M)分离株中的部分群集运动对应于细菌内化的适度减少，而BIM和BIM(M)1中的完全群集运动丧失与上皮进入的显著减少相关。值得注意的是，虽然所有抗性克隆都表现出细胞毒性的降低和生物膜形成的受损，但暴露于黏蛋白的分离株保留了选定的毒力相关特征。BIM菌株中青霉素apphire积累的延迟可能反映了QS或代谢适应的改变，这支持了黏蛋白可以调节抗性相关适应性成本并允许保留特定毒力表型的观点。尽管这项分析基于有限数量的抗性分离株，但这些发现表明，富含黏蛋白的环境施加了额外的选择压力，塑造了噬菌体暴露病原体的表型变异范围。几种机制可能解释了本研究中观察到的黏蛋白的双重效应。我们的附着和内化试验表明，可溶性黏蛋白减少了细菌与上皮细胞的结合，这表明黏蛋白改变了上皮界面，而不是促进细菌入侵。相反，细菌长时间暴露于黏蛋白产生了具有增加细胞毒性的无细胞分泌组，表明细胞外因子也导致了上皮损伤。此外，黏蛋白没有损害DMS3vir的扩增，噬菌体治疗一致地保护上皮细胞免受细菌细胞毒性的损害。这些发现与BAM模型一致，该模型认为黏膜环境可能促进噬菌体与细菌之间的相互作用，尽管没有直接研究噬菌体在黏蛋白上的保留、扩散和吸附。总之，富含黏蛋白的环境增加了上皮细胞对铜绿假单胞菌的易感性，同时增强了噬菌体介导的上皮保护。通过重塑上皮反应、细菌附着、细胞外细胞毒性、噬菌体表现和进化轨迹，黏蛋白成为感染结果的重要决定因素。这些发现强调了在开发基于噬菌体的治疗策略时考虑黏膜环境的重要性。

研究的局限性
虽然这项研究提供了关于黏蛋白、细菌、噬菌体和上皮细胞相互作用的新机制见解，但仍应承认几个局限性。A549和HT-29细胞是癌源模型，不能完全再现呼吸道上皮的复杂性。尽管我们包括了高毒性的铜绿假单胞菌实验室菌株PA14和低毒性的临床分离株573，但大多数机制实验都是用PA14进行的。因此，应谨慎解释这些发现，因为它们可能不能完全代表与慢性呼吸道感染相关的铜绿假单胞菌分离株的多样性。此外，PGM虽然由于其丰富的类似人类的MUC5AC和糖基化结构而被广泛用作实验模型，但它并不能完全反映人类呼吸道黏液的生化和生物物理复杂性，后者包含多种黏蛋白、抗菌蛋白和其他宿主来源的成分。这些组成差异可能会影响细菌感知、毒力调节和噬菌体行为。选择0.2%的PGM浓度是因为它被广泛用于黏蛋白-细菌研究，并且在我们的模型中诱导了上皮转录重塑和细菌依赖的反应，而不影响上皮细胞的存活率或显著改变细菌生长。不同的黏蛋白浓度可能会对表型输出产生不同的影响。最后，尽管我们的附着和分泌组实验提供了关于上皮易感性增加的机制见解，但涉及的具体细菌因素和BAM模型的贡献仍有待确定。未来使用分化的呼吸道模型、临床分离株、多种黏蛋白来源和多种噬菌体的研究将对验证和扩展这些发现非常重要。

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如需进一步信息和资源，请联系主要联系人Lotta-Riina Sundberg ([e-mail])。

材料可用性
本研究生成的所有独特/稳定的试剂均可从主要联系人处获得，前提是签订了完整的材料转让协议。

数据和代码可用性
• 处理后的RNA-seq数据已存放在GEO，相应的原始测序读段可通过NCBI SRA获得。原始细菌全基因组测序读段也可通过NCBI SRA获得。本研究生成的其他数据集已存放在Mendeley Data。所有数据集在发表日期均为公开可获取，访问编号和DOI信息在关键资源表中列出。本文报告的数据将在需要时由主要联系人提供。
• 本研究使用的原始代码已存放在Mendeley Data，并在发表日期时公开可用。DOI在关键资源表中列出。
• 如需重新分析本文报告的数据，可以从主要联系人处获得任何额外的信息。

致谢
我们感谢Jenne Auramo和Petri Papponen在实验室中的帮助，感谢Georg Eliava噬菌体、微生物学与病毒学研究所的Nina Chanisvili博士捐赠了铜绿假单胞菌菌株573，感谢赫尔辛基大学的Ville Friman教授捐赠了噬菌体DMS3vir，以及感谢于韦斯屈莱大学的Varpu Marjom?ki教授提供了用作IFNB表达阳性对照的肠道病毒Coxsackievirus A9 (CVA9)。该研究由芬兰研究委员会（项目编号#346772，L.-R.S.）和挪威北极大学的新抗菌策略中心（项目编号#2520855，G.M.F.A.）资助。

作者贡献
概念化：D.O.P., G.M.F.A. 和 L.-R.S.；数据管理：D.O.P.；形式分析：D.O.P.；资金获取：L.-R.S.；调查：D.O.P., K.N., I.S., L.W.G. 和 V.S.；方法学：D.O.P., V.S., G.M.F.A. 和 L.-R.S.；项目管理：D.O.P. 和 L.-R.S.；资源：L.-R.S.；软件：D.O.P.；监督：G.M.F.A. 和 L.-R.S.；验证：D.O.P., G.M.F.A. 和 L.-R.S.；可视化：D.O.P.；写作——初稿：D.O.P.；写作——审稿和编辑：D.O.P., K.N., I.S., L.W.G., V.S., G.M.F.A. 和 L.-R.S.

利益声明
我们声明L.-R.S. 和 G.M.F.A. 拥有题为“改进的噬菌体生产、定量和分离方法及培养基”的专利（https://patentscope.wipo.int/search/en/WO2019150003）。

STAR★ 方法

关键资源表
试剂或资源
来源
细菌和病毒菌株
铜绿假单胞菌菌株PA14
实验室库存
DSM 1988
铜绿假单胞菌菌株573
实验室库存
Freschi等人
噬菌体DMS3vir
实验室库存
Cady等人
抗性铜绿假单胞菌克隆

本文
N/A

化学品、肽和重组蛋白
Dulbecco改良Eagle培养基 (DMEM)
Thermo Fisher Scientific
Cat# 52100039
胎牛血清 (FBS)
Thermo Fisher Scientific
Cat# A5256701
GlutaMAX?补充剂
Thermo Fisher Scientific
Cat# 35050038
青霉素-链霉素
Thermo Fisher Scientific
Cat# 15140122
III型猪胃黏蛋白
Sigma-Aldrich
Cat# M1778
人TNF-α重组蛋白
Thermo Fisher Scientific
Cat# PHC3011
二甲基亚砜 (DMSO)
Sigma-Aldrich
Cat# D8418
胰蛋白酶-EDTA
Thermo Fisher Scientific
Cat# 15400054
Trypan Blue溶液
Thermo Fisher Scientific
Cat# 15250061
庆大霉素
Thermo Fisher Scientific
Cat# 15710064
Triton? X-100
Sigma-Aldrich
Cat# X100
氯仿
Sigma-Aldrich
Cat# C2432
结晶紫
Sigma-Aldrich
Cat# C0775

关键商业试剂
RNeasy Mini试剂盒
Qiagen
Cat# 74106
高容量cDNA逆转录试剂盒
Thermo Fisher Scientific
Cat# 4368813
GoTaq? qPCR Master Mix
Promega
Cat# A6002
EndoTrap? HD 1/1
Lionex
Cat# LET0009
Pierce? 色谱内毒素定量试剂盒
Thermo Fisher Scientific
Cat# A39552
SDNeasy Blood & Tissue试剂盒
Qiagen
Cat# 69504

存档数据
RNA-seq数据
GEO
GSE307737
原始RNA-seq和全基因组测序数据
NCBI SRA (BioProject)
PRJNA1308451

数据集和原始代码
Mendeley Data
https://doi.org/10.17632/z4rkkpyxcj.1

实验模型：细胞系
A549
ATCC
RRID: CVCL_0023
HT-29
ATCC
RRID: CVCL_0320

寡核苷酸
Myc_526
正向：ACATTGGGACTGAGATACGGC
本文
N/
Myc_1031_
反向：TCGTTTACGGCGTGGACTAC
本文
N/
18S_
正向：TAGAGGGACAAGTGGCGTTC
本文
N/
18S_反向：CGCTGAGCCAGTCAGTGT
本文
N/
ahIL6_
正向：CCACACAGACAGCCACTCAC
本文
N/
ahIL6_反向：AGGTTGTTTTCTGCCAGTGC
本文
N/
ahIL8_
正向：ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC
本文
N/
ahIL8_反向：AACCCTCTGCACCCAGTTTTC
本文
N/
ahIFNB_
正向：AAACTCATGAGCAGTCTGCAT
本文
N/
ahIFNB_反向：AGGAGATCTTCAGTTTCGGAGG
本文
N/
ahIFNL1_
正向：TTCCAAGCCCACCACAACTG
本文
N/
ahIFNL1_反向：GAGTGACTCTTCCAAGGCGT
本文
N/
oprL_
正向：AACAGCGGTGCCGTTGAC
本文
N/
oprL_反向：GTCGGAGCTGTCGTACTCGAAT
本文
N/
algD_
正向：GCGACCTGGACCTGGGCT
本文
N/
algD_反向：GCGACCTGGACCTGGGCT
本文
N/
ArhlR_
正向：GCGTCAAGAAAGAAACCCGTCTG
本文
N/
ArhlR_反向：GGCGTAAATGTGCTGGGAAGAG
本文
N/
ArhlI_
正向：CTCTCTGAATCGCTGGAAGG
本文
N/
ArhlI_反向：CGACGATGTAGCGGGTTT
本文
N/
AlasR_
正向：GCGCCATCGGCAAGACCAG
本文
N/
AlasR_反向：GCGGGAGGTCACACCGAAC
本文
N/
AlasI_
正向：GTAGGCGTGGAGAAGATGATG
本文
N/
AlasI_反向：ATCTGGGTCTTGGCATTGAG
本文
N/
重组DNA
p_m16S质粒
Addgene
Cat# 160549

软件和算法
GraphPad Prism (v10.3.0)
GraphPad
RRID: SCR_002798
ImageJ2 (v2)
Schneider等人
RRID: SCR_003070R (v4.5.1)
R Foundation
RRID: SCR_001905
FastQC (v0.12.1)
Babraham Institute
RRID: SCR_014583
MultiQC (v1.31)
Ewels等人
RRID: SCR_014982
fastp (v0.23.4)
Chen等人
RRID: SCR_016962
STAR (v2.7.11b)
Dobin等人
RRID: SCR_015899
HTSeq (v2.0.3)
Anders等人
RRID: SCR_005514
BWA-MEM (v0.7.19)
Li等人
RRID: SCR_010910
SAMtools (v1.21)
SAMtools项目
RRID: SCR_002105
GATK工具包 (v4.6.2)
DePristo等人
RRID: SCR_001876
VarScan (v2.4.2)
Koboldt等人
RRID: SCR_006849
bcftools (v1.12)
https://doi.org/10.1101/090811
RRID: SCR_005227
SPAdes (v4.0.0)
Nurk等人
RRID: SCR_000131
MinCED (v0.2.0)
Bland等人
N/A
DESeq2 (v1.50.0)
Bioconductor
RRID: SCR_015687
edgeR (v4.18.1)
Bioconductor
RRID: SCR_012802
VariantAnnotation (v1.52.0)
Bioconductor
RRID: SCR_01262
clusterProfiler (v4.18.1)
Bioconductor
RRID: SCR_016884
biomaRt (v2.66.0)
Bioconductor
RRID: SCR_019214
org.Hs.e.g.,.db (v3.22.0)
Bioconductor
RRID: SCR_02473
GemomicRanges (v1.62.0)
Bioconductor
RRID: SCR_021325
Biostrings (v2.78.0)
Bioconductor
RRID: SCR_016949
ComplexHeatmap (v2.26.0)
Bioconductor
RRID: SCR_017270
circlize (v.4.16)
CRAN
RRID: SCR_002141
ggplot2 (via tidyverse (v2.0.0))
CRAN
RRID: SCR_014601

其他
5 μm Millex?-SV过滤器
Sigma-Aldrich
Cat# SLSV025
LS0.22使用III型猪胃黏蛋白（PGM）制备了富含黏蛋白的条件，这种黏蛋白能够复制人类MUC5AC的结构特征，并且之前已被用于噬菌体-细菌-黏蛋白的研究。首先在PBS中配制2%（w/v）的PGM贮备液，经过高压灭菌处理后通过5-μm过滤器过滤，然后根据每个实验的需要稀释到相应的浓度。对照组接受等体积的PBS。人类TNF（100 ng/mL）被用作qPCR测定的阳性对照，而20%的DMSO则用作细胞活力测定的阳性对照。

### 细菌制备和生长测定
在实验中，将单个菌落接种到5 mL的LB培养基中，于37°C下以200 rpm的速度搅拌过夜培养。然后将培养物以1:1的比例稀释到新鲜的LB培养基中，并在相同条件下继续培养1小时。细菌通过4,000 x g的离心力在室温（约22°C）下离心5分钟，用PBS洗涤后重新悬浮在LB培养基或不含抗生素的DMEM中，后者需添加10%的FBS和1%的GlutaMAX（具体取决于实验要求）。细菌悬浮液被调整至OD600 = 0.3（约2 x 10^8 CFU/mL），之后进一步稀释至所需的接种浓度。细菌浓度通过CFU计数或使用Multiskan FC微孔板光度计测量OD600来确定。在生长曲线实验中，每30分钟在37°C下测量一次OD600值，并使用Infinite M Nano微孔板读数器进行振荡。

### 细胞活力测定
按照实验处理方案，收集培养上清液和细胞到微量离心管中。用0.05%的胰酶在37°C下处理5分钟以分离贴壁细胞，然后与相应的上清液混合。样品在4°C下以270 x g的离心力离心5分钟，细胞沉淀物重新悬浮在添加了10% FBS的DMEM中。将细菌悬浮液与Trypan Blue以1:1的比例混合后转移到细胞计数室内，使用TC20自动细胞计数器测定存活细胞和死亡细胞的数量。

### RNA提取、逆转录和实时PCR
总RNA使用RNeasy Mini Kit提取。逆转录使用High-Capacity cDNA逆转录试剂盒进行，输入量为200 ng的总RNA。定量实时PCR（qPCR）在CFX96 C1000实时PCR检测系统上使用GoTaq qPCR Master Mix完成。反应体系中包含2 μL的1:10稀释的cDNA和引物，最终浓度为0.2 μM，总反应体积为10 μL。人类18S rRNA被用作分析人类基因表达的参考基因。铜绿假单胞菌的oprL基因被用作细菌参考基因。相对基因表达使用CFX Maestro v2.3中的2^-ΔΔCt方法计算（Bio-Rad）。引物序列详见关键资源表。

### 细菌内化测定
细菌内化的程度通过庆大霉素保护实验进行定量。细菌暴露后，上皮细胞与400 μg/mL的庆大霉素在37°C下孵育1小时以清除细胞外的细菌。庆大霉素处理的效力见图S5。处理完成后，细胞用PBS洗涤，然后用0.05%的胰酶和0.2%的Triton X-100处理以释放细胞内的细菌。释放的细菌通过系列稀释和CFU计数进行定量。没有上皮细胞的对照组作为阴性对照。

### 细菌黏附测定
为了定量细菌对上皮细胞的黏附，首先去除培养上清液，然后用PBS轻轻洗涤细胞三次以去除非黏附细菌。随后裂解上皮细胞以回收所有与细胞相关的细菌，包括黏附细菌和细胞内细菌。同时，使用上述的庆大霉素保护实验方法定量细胞内细菌。黏附细菌的数量通过从总与细胞相关细菌数中减去细胞内细菌数得到。

### 细菌分泌组细胞毒性测定
铜绿假单胞菌培养物在添加了10% FBS的DMEM中于37°C下静态培养6小时或24小时。无细菌的对照培养基在相同条件下培养。培养结束后，细菌培养物以4,000 x g的离心力离心5分钟，所得上清液通过无菌0.22-μm注射器过滤器去除活细菌，同时保留可溶性分泌成分。A549细胞在37°C和5% CO2条件下暴露于无细菌的分泌组中5小时。随后使用上述的细胞活力测定方法量化上皮细胞的毒性。通过CFU计数确认过滤后的分泌组中不含活细菌。

### 吲哚蓝绿素产生
通过氯仿-HCl提取法定量吲哚蓝绿素的产生。过夜培养的细菌在LB培养基中稀释至OD600 = 0.1，然后于37°C下在12孔板中培养6小时或24小时，使用DTS-4振荡器。培养物以5,000 x g的离心力离心10分钟，上清液与氯仿以5:3的比例混合并剧烈振荡。所得有机相与0.2 M HCl以2:1的比例混合后进行振荡。使用Infinite M Nano微孔板光度计在520 nm波长下测量水相的吸光度。

### 生物膜形成测定
过夜培养的细菌稀释至OD600 = 0.1，然后接种到96孔板中。培养物在37°C下静态培养24小时。培养后，用清水洗涤板子，并在室温下用0.1%的结晶紫染色20分钟。多余的染色剂被洗掉，然后将板子晾干。用96%乙醇溶解生物膜中的结晶紫，使用Multiskan FC微孔板光度计在595 nm波长下测量吸光度。

### 噬菌体繁殖、纯化和滴定
使用铜绿假单胞菌PA14作为细菌宿主来繁殖DMS3vir噬菌体。噬菌体裂解产物通过0.22-μm过滤器过滤，再用10%的氯仿处理，并使用100-kDa分子量截留值的Amicon离心过滤器浓缩。随后使用EndoTrap HD 1/1 Kit纯化噬菌体。内毒素浓度使用Pierce Chromogenic Endotoxin Quant Kit测定。纯化后，内毒素水平从7,158 EU/10^9 PFU降低到2 EU/10^9 PFU。噬菌体滴度使用双层琼脂法测定，纯化的噬菌体储存在4°C。

### 噬菌体抗性细菌的分离
在A549培养物中加入DMS3vir孵育24小时后，分离出具有噬菌体抗性的铜绿假单胞菌克隆。从两种噬菌体暴露条件下各获得三个独立菌落：BIM代表与DMS3vir共存的A549细胞，BIM(M)代表与DMS3vir和0.2%黏蛋白共存的A549细胞。对照组包括PA14(WT)（原始菌株）、暴露于A549细胞后回收的PA14(C)以及暴露于含0.2%黏蛋白的A549细胞后回收的PA14(M)。分离出的菌落至少重新划线三次以获得纯化的克隆，并储存在-80°C下的15%甘油溶液中。

### 细菌运动性测定
对于游动运动性测定，将细菌培养物稀释至OD600 = 0.1，每2 μL的悬浮液滴加到LB软琼脂上。培养物在37°C下静态培养24小时。游动模式用尺子标记并使用ImageJ2 v2软件量化菌落直径。对于蠕动运动性测定，使用接种针将细菌菌落刺入LB琼脂底部并在37°C下培养48小时。培养后去除琼脂，并用0.1%结晶紫染色板子。蠕动区域被成像并使用ImageJ2 v2软件量化其直径。

### RNA测序和分析
使用RNeasy Mini Kit从对照组和黏蛋白处理组的A549细胞中提取总RNA（每组n = 3个生物重复样品）。使用Agilent 2100 Bioanalyzer评估RNA完整性，RNA完整性数（RIN）>8的样品被用于测序。RNA链特异性mRNA文库由BGI Tech（中国）使用DNBseq平台进行测序，每个样本产生约20–30百万条读段。测序数据使用Chipster RNA-seq工作流程（2025年10月访问）和默认参数处理。差异表达分别使用DESeq2和edgeR独立评估。在两种分析中FDR <0.05的基因作为DESeq2和edgeR结果的交集保留。基因注释使用biomaRt获取，并与org.Hs.eg.db合并。使用1,000个变化最大的基因进行主成分分析。数据可视化使用ggplot2和ComplexHeatmap完成。基因本体富集通过过度表达分析（ORA）评估，并通过clusterProfiler进行基因集富集分析（GSEA）补充。富集术语以条形图形式呈现。

### 全基因组测序和分析
使用DNeasy Blood & Tissue Kit从铜绿假单胞菌分离株中提取基因组DNA，并使用Qubit荧光计进行定量。插入片段长度≤800 bp的测序文库由BGI Tech使用DNBseq平台进行测序，每个样本产生约20–30百万条读段。由于技术问题，BIM2样本的测序失败，因此未将其纳入后续的全基因组分析。过滤后的读段使用fastp处理，质量控制指标使用MultiQC汇总。使用BWA-MEM将读段与铜绿假单胞菌UCBPP-PA14参考基因组（NC_008463.1）对齐。对齐结果使用SAMtools和GATK MarkDuplicates处理。变异体使用SAMtools mpileup和VarScan命名。在R中使用VariantAnnotation结合P. aeruginosa UCBPP-PA14 GFF注释和UniProt信息进行变异体注释。同义背景变异体被排除在后续分析之外。热图使用ComplexHeatmap生成，携带变异体的基因根据KEGG通路/功能分组并用堆叠条形图显示。

### 全基因组测序和分析
使用DNeasy Blood & Tissue Kit从铜绿假单胞菌分离株中提取基因组DNA，并使用Qubit荧光计进行定量。长度≤800 bp的测序文库由BGI Tech使用DNBseq平台进行测序。BIM2样本的测序因技术问题失败，因此未纳入后续的全基因组分析。过滤后的读段使用fastp处理，质量控制指标使用MultiQC总结。使用BWA-MEM将读段与铜绿假单胞菌UCBPP-PA14参考基因组（NC_008463.1）对齐。对齐结果使用SAMtools和GATK MarkDuplicates处理。变异体使用VariantAnnotation和P. aeruginosa UCBPP-PA14 GFF注释及UniProt信息进行注释。同义背景变异体被排除在后续分析之外。热图使用ComplexHeatmap生成，携带变异体的基因根据KEGG通路/功能分组并用堆叠条形图显示。

### 统计分析和报告
统计分析使用GraphPad Prism v10.3.0和R v4.5.1完成。数据以平均值±标准误差（mean ± SEM）表示，除非另有说明。每个实验的独立生物重复次数（n）、n的定义及应用的统计测试在相应的图例中报告。p值在图例中给出，p < 0.05被视为统计显著。两组之间的比较使用双尾Student's t检验进行。涉及多组的比较使用单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey的多重比较检验。涉及两个独立变量的实验使用双因素方差分析（two-way ANOVA）后进行Sidak的多重比较检验。RNA-seq分析每个实验组使用三个独立生物重复样本。差异基因表达分别使用DESeq2和edgeR独立评估。DESeq2的统计显著性使用Wald检验确定，而edgeR使用准似然F检验。p值使用Benjamini-Hochberg方法进行多重比较校正，FDR < 0.05的基因被视为差异表达。RNA-seq样本量基于检测到>1.5的倍数变化且功效为α = 0.05。CRISPR间隔区数据的推断统计检验未被应用，这些数据仅做描述性展示。除非另有说明，否则所有实验数据均被纳入分析。

### 补充信息（6）
- 下载所有文件：PDF（733.18 KB），包括文档S1（图S1–S5）、电子表格（121.25 KB）、数据S1（A549细胞暴露于黏蛋白的差异表达基因分析数据，与图1和S1相关）、数据S2（A549细胞暴露于黏蛋白的GO富集分析数据，与图1相关）、数据S3（铜绿假单胞菌PA14分离株的全基因组测序数据，与图S4相关）、数据S4（铜绿假单胞菌PA14分离株突变基因的功能/通路注释数据，与图S4相关）、数据S5（铜绿假单胞菌PA14分离株的CRISPR间隔区获取数据，与图S4相关）。