《Cosmetics》：Comparative Effects of Botulinum Toxin A, α-Bungarotoxin, Myricetin, and a Natural Extract Blend on Neurotransmitter Levels and Gene Expression in Human Skin Explants
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注射用肉毒神经毒素（BoNT）通过裂解神经肌肉接头处的SNARE蛋白来减少动态皱纹；然而，其大分子尺寸主要限制了其仅可用于注射类操作。某些多酚类化合物（包括杨梅素）已被证实在神经元系统中可通过抑制SNARE复合体的拉链化过程来减少乙酰胆碱（ACh）诱导的肌
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注射用肉毒神经毒素（BoNT）通过裂解神经肌肉接头处的SNARE蛋白来减少动态皱纹；然而，其大分子尺寸主要限制了其仅可用于注射类操作。某些多酚类化合物（包括杨梅素）已被证实在神经元系统中可通过抑制SNARE复合体的拉链化过程来减少乙酰胆碱（ACh）诱导的肌肉收缩，提示其具有作为皮肤胆碱能活性调节剂进行局部外用的潜力。本研究旨在鉴定一种能够类似地降低ACh水平的天然提取物复合物，随后在人皮肤外植体上对该提取物的活性进行表征，并与参考分子BoNT/A、α-银环蛇毒素及杨梅素进行比较。该天然提取物复合物（"Blend 1"）在细胞培养系统中抑制了囊泡融合并减弱了去甲肾上腺素释放，在神经/肌肉共培养中抑制了肌肉细胞收缩，并在人皮肤外植体中降低了ACh水平，其效果与杨梅素及参考神经毒素一致。对处理后的离体皮肤外植体进行整体转录组学分析显示，BoNT/A、杨梅素和Blend 1均共享一个类似的炎症及抗病毒基因下调谱，该谱与α-银环蛇毒素的谱不同；但杨梅素和Blend 1在上调与皮肤稳态和修复相关的基因方面存在高度重叠，而两种毒素均未观察到该现象。这些数据支持Blend 1作为局部化妆品应用的候选物，其通过调节BoNT/A样胆碱能通路，同时激活与皮肤稳态和修复相关的额外通路发挥作用。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
皮肤衰老是一个多层次的复杂过程，不仅涉及表皮和真皮等浅层结构的变化，还与皮下脂肪质量及基底肌肉张力等深层因素密切相关。在众多抗衰老手段中，肉毒毒素注射是目前最常用且有效的医美操作之一。肉毒毒素A型（BoNT/A）通过受体介导的内吞作用进入神经肌肉接头处的运动神经末梢，其轻链能够切割可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）复合体中的关键蛋白SNAP-25，从而阻断乙酰胆碱（ACh）的囊泡释放，导致肌肉麻痹，达到减少皱纹的临床效果。
然而，BoNT/A蛋白分子量巨大，必须由专业医疗人员注射给药，其成本和侵入性限制了患者的可及性。因此，寻找具有更低分子量和更优皮肤渗透性的天然替代物成为研究热点。多酚类化合物因其结构多样性和在化妆品中使用的安全性历史受到关注。已有研究筛选出多种能够阻止SNARE复合体形成的多酚结构，其中杨梅素（Myricetin）因其低分子量和高效率尤为引人注目。与BoNT/A不可逆地切割SNAP蛋白不同，杨梅素通过结合SNARE复合体中间区域、阻止其拉链化过程来发挥作用，这一机制是可逆的且具有更优的安全性特征。动物实验已证实杨梅素及类似多酚注射后能抑制肌肉收缩，起效更快且在高浓度下无毒性。
基于上述背景，本研究旨在探索BoNT/A的局部外用替代方案，通过考察杨梅素及含有杨梅素和结构相似多酚的天然提取物复合物在SNARE介导机制下抑制神经肌肉收缩的能力，并将研究拓展至完整人皮肤，检测神经毒素和天然提取物处理对离体人皮肤外植体中ACh水平的影响，进而通过整体转录组学分析表征这些化合物的生物学响应。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员首先基于已发表的植物黄酮醇含量调查数据，选择了番石榴（Psidium guajava）果实和叶片、大蒜（Allium sativum）鳞茎、丝瓜（Luffa cylindrica）果实、红茶（Camellia sinensis）叶片及白睡莲（Nymphaea alba）花五种植物材料，经水提取和冻干获得各植物提取物粉末。随后按专有比例将这五种提取物组合成五个候选复合物（Blend 1-5），通过膜融合定量和PC12细胞去甲肾上腺素分泌定量两个筛选实验选出活性最佳的Blend 1用于后续实验。
关键技术方法包括：基于荧光共振能量转移（FRET）的脂质混合实验用于定量评估化合物对SNARE介导膜融合的抑制效果；PC12细胞去甲肾上腺素分泌定量作为功能性替代指标；人诱导多能干细胞（iPSC）来源运动神经元与人骨骼肌细胞共培养体系用于直接测量肌肉收缩频率；人皮肤外植体培养及ACh定量检测；以及整体转录组学分析（bulk transcriptomics）。皮肤外植体来自韩国盆唐首尔大学医院伦理委员会批准的腹部或胸部手术后女性捐赠者样本，ACh定量实验使用单一位捐赠者的外植体重复三次，转录组学分析使用九位不同捐赠者的独立皮肤样本，分三批处理。
三、研究结果
3.1 天然提取物复合物对囊泡融合和去甲肾上腺素释放的抑制评估
在五种候选复合物中，Blend 1在FRET脂质混合实验中表现出最大程度的膜融合抑制，且呈剂量依赖性。在PC12细胞去甲肾上腺素释放实验中，Blend 1同样表现出最强的抑制作用。两项筛选数据共同确定Blend 1为五个候选配比中活性最佳的复合物。
3.2 神经毒素、杨梅素和Blend 1抑制肌肉细胞去极化
在iPSC来源神经元与骨骼肌细胞共培养体系中，处理2小时后仅最高浓度的Blend 1表现出肌肉收缩减少。然而在处理24小时后，所有测试处理（α-银环蛇毒素、杨梅素和Blend 1）均表现出显著的肌肉收缩频率降低，部分条件下几乎完全消除肌肉收缩，提示神经肌肉接头信号传导近乎完全被抑制。所有化合物在测试浓度下均未显示毒性。
3.3 BoNT/A、杨梅素和Blend 1降低人皮肤外植体中的ACh水平
单日处理后，杨梅素和Blend 1处理的培养物中ACh水平即出现下降，而BoNT/A和α-银环蛇毒素未显示效果。当处理延长至连续三天时，BoNT/A处理导致ACh下降，杨梅素和Blend 1继续维持ACh降低效果。α-银环蛇毒素作为烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的竞争性拮抗剂，并未降低ACh水平反而使其升高，这与其突触后作用机制一致。
3.4 离体皮肤外植体经BoNT/A、杨梅素和Blend 1处理后呈现重叠但不同的转录组谱
转录组分析显示：BoNT/A处理诱导328个差异表达基因（66个上调，262个下调）；α-银环蛇毒素诱导109个基因（38个上调，71个下调）；杨梅素诱导439个基因（184个上调，255个下调）；Blend 1诱导155个基因（107个上调，48个下调）。基因本体（GO）富集分析表明，BoNT/A下调通路主要涉及病毒防御和先天免疫应答，特别是干扰素刺激基因（ISG），包括ISG15、IFI44、MX1、IFI44L、OAS2、CMPK2和HERC6。α-银环蛇毒素则呈现截然不同的转录组特征，下调通路与血管发育和血管生成相关，上调通路与角质化相关。BoNT/A与α-银环蛇毒素的下调基因重叠极少（262个中仅3个），表明两者虽均作用于神经肌肉接头但机制差异显著。
杨梅素与BoNT/A共享39个下调基因，与α-银环蛇毒素共享33个下调基因，其下调谱包含与BoNT/A相似的炎症/干扰素抑制核心。杨梅素上调基因涉及上皮相关基因和基质/重塑相关转录本，如FGF10、CXCL12、LYVE1和THY1。Blend 1与BoNT/A和杨梅素共享17个下调基因，GO分析显示其通路调节特征与BoNT/A相似，集中于病毒防御应答和干扰素相关通路。Blend 1的上调转录组响应与杨梅素高度相似，107个上调基因中有48个与杨梅素重叠，而仅各2个与BoNT/A和α-银环蛇毒素共享，特别涉及FGF10、CXCL12、LYVE1和THY1等与皮肤稳态相关的基质/血管重塑基因。
热图分析进一步确认了三个生物学程序：七个干扰素刺激基因在BoNT/A、杨梅素和Blend 1处理的皮肤外植体中均下调，构成共享的先天免疫抑制特征；α-银环蛇毒素则以下调VCAM1和POSTN及上调终末分化标志物LCE1B为特征；杨梅素和Blend 1额外共享FGF10、PRG4和HLA-G等基质和免疫相关基因的上调，构成多酚相关的皮肤稳态和修复特征。
四、讨论与结论
研究人员指出，皮肤胆碱能系统包含神经元和非神经元两个组成部分。角质形成细胞能够合成和释放ACh并表达烟碱型和毒蕈碱型受体，成纤维细胞表达α7-nAChR调节细胞外基质产生。皮肤中胆碱能通路的普遍性使其成为调节皮肤质量和炎症反应的有趣靶点。现有研究表明，BoNT/A的局部外用需要借助微针等增强递送系统才能有效渗透皮肤，这促使了更小分子替代物的开发，如模拟SNAP-25序列的六肽Argireline和模拟蛇毒蛋白Waglerin-1活性的二肽Syn-ake。然而这些肽类仍具有相对较高的分子量，本研究探索的天然多酚结构具有更优的皮肤渗透潜力和天然来源优势。
BoNT/A、杨梅素和Blend 1在皮肤外植体中降低ACh的能力与其在神经元系统中的数据一致，表明SNARE介导的囊泡融合抑制及随之而来的神经递质释放减少是肌肉去极化抑制的原因。α-银环蛇毒素升高ACh的现象可能与nAChR阻断后ACh释放负反馈调节紊乱有关。BoNT/A处理呈现的干扰素刺激基因和先天免疫通路抑制特征，可能反映了离体皮肤外植体系统中手术切除和培养造成的应激性炎症背景被抑制，这与既往报道的BoNT/A通过神经元和非神经元机制发挥抗炎作用一致。杨梅素和Blend 1与BoNT/A的不同之处在于其上调基因谱，包含与皮肤稳态和修复相关的转录程序，如FGF10、FAP、PRG4、HLA-G和THY1等，这些多酚激活的皮肤稳态和修复程序是BoNT/A所不具备的，提示这些分子在局部皮肤应用中可能具有功能性优势。
研究结论：研究人员通过初始筛选确定了活性最佳的天然提取物复合物Blend 1，证实其与参考分子α-银环蛇毒素和杨梅素一样能抑制神经/肌肉共培养中的肌肉细胞收缩。BoNT/A、杨梅素和Blend 1均能降低人离体皮肤外植体中的ACh水平，而α-银环蛇毒素不能。研究人员还鉴定出BoNT/A处理的皮肤外植体中涉及病毒防御和先天免疫通路的新转录组特征，该特征与杨梅素和Blend 1部分重叠但与α-银环蛇毒素不同，提示共享的神经皮肤信号调节机制。Blend 1还影响超出BoNT/A共享范围的皮肤稳态和修复相关转录组通路，综合表明该提取物作为改善化妆品皮肤质量的局部外用治疗具有应用前景。
