产前与产后日本黑牛后肠道微生物群落与繁殖性能的关联研究

《animal》：Relationship between fertility and hindgut microbiota of beef cows in pre- and postpartum periods

　　

： 日本黑牛繁殖性能下降是影响和牛牛肉高效生产的主要挑战。本研究以受孕所需人工授精次数（INS）作为繁殖效率的评价指标，发现产前与产后时期的繁殖效率与粪便微生物群谱及血液性状存在显著关联。产前阶段是氧化应激与肠道微生物群密切关联的关键时期，而产后阶段则更能反映肝脏功能与微生物群组成之间的关联。研究结果表明，粪便微生物群及相关血液生物标志物可能有助于识别存在繁殖性能下降风险的母牛，从而支持更具针对性的繁殖管理策略的实施。

论文解读：

一、研究背景与意义

母体胃肠道或生殖道微生物群与人类及家畜的繁殖性能和妊娠结局密切相关。肠道微生物群能够产生生物活性代谢物，这些代谢物可经血液循环进入母体循环，并可能通过主动或被动方式穿过胎盘，进而影响人类、小鼠和母猪的繁殖性能。氧化状态同样在人类和家畜的繁殖性能中发挥关键作用，氧化应激可导致人类女性出现子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征、不明原因不孕和自然流产等生殖系统疾病。产犊间隔延长的荷斯坦奶牛表现出更高的血液丙二醛（MDA）水平，MDA是氧化应激状态的替代标志物。

人工授精是日本黑牛（又称和牛）的主要繁育方式，然而日本肉牛（包括日本黑牛）的受孕率从1987年的66.4%下降至2018年的52.6%，降幅超过20%。尽管已有研究探讨了荷斯坦奶牛繁殖性能、体况评分和代谢谱之间的关系，但关于肉牛的类似信息仍然有限。日本黑牛因其和牛肉需求增长而成为最具经济价值的肉牛品种之一，因此提高该品种的繁殖性能具有重要意义。本研究以受孕所需人工授精次数（INS）作为繁殖性能的替代指标，探讨日本黑牛产前和产后时期INS、粪便微生物群、血浆MDA浓度及血液特征之间的关联。这是首个同时评估粪便微生物群和氧化应激标志物与日本黑牛产前和产后人工授精效率关联的研究。

二、研究设计与技术方法

本研究为观察性研究，在滋贺县畜产技术振兴中心开展，所有实验母牛在相同饲养管理条件下饲养。样本采集时间为2020年7月30日至2021年9月27日，分别于产前（分娩前52至22天，n=53）和产后（分娩后22至52天，n=49）采集个体血液和粪便样本。繁殖性能以INS评估，将母牛分为三组：INS（1）组（首次授精受孕）、INS（2）组（第二次授精受孕）和INS（≥3）组（第三次及以上授精受孕）。研究采用的主要技术方法包括：粪便细菌基因组DNA提取及16S rRNA宏基因组测序，利用QIIME2、USEARCH和UCHIME进行序列数据处理，基于SILVA数据库进行分类学注释；采用Kruskal–Wallis检验和Steel–Dwass方法比较组间α多样性指数（Chao1和Shannon指数）及细菌属相对丰度差异，并使用Benjamini–Hochberg错误发现率（FDR）进行多重比较校正；基于UniFrac距离评估β多样性，通过置换多元方差分析检验组间差异；采用GLM程序分析血浆MDA浓度；通过Spearman相关分析评估粪便细菌相对丰度与血液参数之间的关系。

三、研究结果

（一）粪便微生物群的α多样性和β多样性

产前期，INS（1）组的α多样性指数（Chao1和Shannon指数）显著高于INS（2）和INS（≥3）组（P < 0.01）；产后期间各组间无显著差异。β多样性分析显示，产前期各组间微生物组成存在显著差异（P < 0.001）；产后期间，INS（1）组与INS（2）组及INS（≥3）组之间均存在显著差异（P < 0.001）。

（二）粪便微生物群的分类学组成

产前期共有28个细菌属（占群落>0.1%）的相对丰度在各组间存在显著差异。INS（≥3）组中Rikenellaceae_genus_unknown、Christensenellaceae_R-7_group和Candidatus_Saccharimonas的相对丰度显著高于其他组。INS（1）组中Bacteroides、Muribaculaceae_genus_unknown、p-2534-18B5_gut_group_genus_unknown、Prevotellaceae_UCG-003、Erysipelotrichaceae_genus_unknown、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group_genus_unknown和Phascolarctobacterium的相对丰度显著低于INS（2）和INS（≥3）组。INS（1）组中Fibrobacter相对丰度高于INS（2）组，Treponema高于INS（≥3）组，而Monoglobus和Family_XIII_AD3011_group低于INS（≥3）组。产后期间共有11个细菌属存在显著差异，其中Bacteroidales_RF16_group_genus_unknown在INS（1）组中相对丰度最高，而Candidatus_Saccharimonas在INS（1）组中最低。

（三）血浆丙二醛浓度与血液特征

产前期，INS（≥3）组母牛的血浆MDA浓度显著高于INS（2）和INS（1）组（P < 0.0001）；产后期间，INS（≥3）组显著高于INS（2）组（P < 0.0001）。产前期，INS（1）组总胆固醇浓度有高于INS（≥3）组的趋势（P = 0.057）；产后期间，INS（≥3）组的天冬氨酸氨基转移酶（AST）浓度显著高于INS（1）组（P = 0.029），γ-谷氨酰转肽酶（γ-GTP）浓度显著高于INS（2）组（P = 0.002）。

（四）微生物群丰度与血液参数的Spearman相关分析

产前期，Erysipelotrichaceae_genus_unknown（r = 0.63）、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group_genus_unknown（r = 0.52）、Methanobrevibacter（r = 0.50）、Bacteroides（r = 0.50）、p-2534-18B5_gut_group（r = 0.48）、UCG-005（r = 0.45）、Phascolarctobacterium（r = 0.43）等细菌属与血浆MDA浓度呈显著正相关；而WCHB1-41_genus_unknown（r = ?0.61）、UCG-010_genus_unknown（r = ?0.54）、Bacteroidales_RF16_group_genus_unknown（r = ?0.43）、Izemoplasmatales（r = ?0.39）、Paludibacteraceae_uncultured（r = ?0.39）、Mailhella（r = ?0.36）、Treponema（r = ?0.34）等与血浆MDA浓度呈显著负相关。产后期间，未观察到细菌属相对丰度与血浆MDA浓度之间存在显著相关性。产后期间，Family_XIII_AD3011_group（r = 0.50）、Bacteroides（r = 0.46）、Candidatus_Saccharimonas（r = 0.40）、Phascolarctobacterium（r = 0.39）与血清AST浓度呈显著正相关。

四、讨论与结论

本研究证实，以INS评估的繁殖性能与日本黑牛粪便微生物群组成、血浆MDA浓度（氧化应激状态的替代标志物）及血液生化特征相关。产前时期，INS（1）组母牛具有更高的α多样性指数，这与先前关于高繁殖性能母猪具有更高α多样性的研究结果一致。产前阶段氧化应激与肠道微生物群密切关联，血浆MDA浓度随INS增加而升高，且多个与氧化应激相关的细菌属与MDA浓度显著相关。Bacteroides、Erysipelotrichaceae_genus_unknown、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group和Phascolarctobacterium在INS（1）组中相对丰度较低且与MDA浓度正相关，这些菌属此前在胎儿生长受限的女性和小鼠模型中被发现。Christensenellaceae_R-7_group和Monoglobus在INS（≥3）组中相对丰度较高且与MDA正相关，先前研究表明这些菌属与慢性炎症和氧化应激状态相关。相反，Treponema、Fibrobacter和Bacteroidales_RF16_group与MDA浓度负相关，且在INS（1）组中相对丰度较高，此前在母猪研究中发现这些菌属在高繁殖力组中丰度更高。产后阶段，血清AST浓度和Alloprevotella相对丰度与繁殖性能相关，提示肝脏功能与微生物群的关联在产后更为突出。产前与产后时期微生物群与MDA相关性模式的差异可能归因于不同繁殖阶段宿主代谢状态的变化，包括非酯化脂肪酸、总酮体和3-羟基丁酸浓度在产前高于产后。

研究结论表明，日本黑牛产前和产后时期的粪便微生物群组成在不同INS组间存在差异，提示后肠道微生物群与繁殖性能之间存在关联。产前阶段血浆MDA浓度和产后阶段血清AST浓度与特定粪便细菌属相关，这些发现提示粪便微生物群组成、氧化状态、肝脏功能和繁殖性能之间存在关联。由于本研究为观察性研究，潜在的生物学机制尚不明确，需要进一步研究以阐明这些关联是否反映因果关系。