## 一、标题 冷冻保存的马脐带组织同种异体移植物（eUTA）显微结构与生物学特性表征：可降解生物支架的蛋白缓释与细胞外囊泡（EVs）特征

《Veterinary Medicine: Research and Reports》：Microscopic and Biological Characterization of Cryopreserved Equine Umbilical Tissue Allograft

　　

## 三、摘要翻译

目的 Equicenta?CTM是一种经冷冻保存的微米化马脐带来源组织同种异体移植物（eUTA），经最低限度加工处理，在结缔组织基质中含有丰富的胎儿蛋白。本研究旨在表征该eUTA的显微结构、生物降解特性，以及其作为组织支架储库释放生物学相关蛋白（包括细胞因子、生长因子和细胞外囊泡（EVs））的潜能。方法 采用立体培养与沉淀涂片法对eUTA进行显微评估。在组织培养悬液中采用胶原酶或胰蛋白酶（阳性对照）进行体外酶消化以评估形态学变化。通过24小时消化研究定量总蛋白、1型胶原α1链（Col1A1）及金属蛋白酶组织抑制因子-2（TIMP-2）。在去垢剂提取前后采用多重ELISA检测合成代谢、抗炎及抗分解代谢生物介质。采用纳米颗粒追踪分析与四次跨膜蛋白（tetraspanin）检测评估EVs。结果 显微镜检查显示蛋白样基质中存在自由漂浮的微粒聚集体和纤维状网样细胞外基质支架。胶原酶引起基质逐渐崩解，而胰蛋白酶导致快速、完全的降解。eUTA含有多种细胞因子和生长因子；在支架消化或提取后，部分合成代谢与抗分解代谢蛋白升高，包括胰岛素样生长因子（IGF-1）、α-2巨球蛋白（A2M）和TIMP-2。Col1A1在胶原酶消化过程中于24小时内持续释放。EV分析证实存在大量表达CD9、CD63和CD81的颗粒。结论 对eUTA的显微评估显示出一个复杂的丝状微粒基质，可作为骨科损伤中内源性组织修复的支架。该基质可被天然存在的蛋白水解性胶原酶降解，从而随时间释放基质蛋白和生物活性因子，可能支持愈合过程。

## 四、论文解读

**研究背景** 马匹的关节、肌腱和韧带等肌肉骨骼损伤是导致训练日损失、运动表现下降和提前退役的主要原因，而经典疗法（如反复使用皮质类固醇或非甾体抗炎药）往往仅能缓解症状，难以可靠恢复正常的结构与功能。结合丰富促修复蛋白谱与生物相容性支架的骨科生物学策略因此受到关注。微粒化生物支架如脐带组织同种异体移植物（eUTA）被认为兼具递送复杂生物活性蛋白与提供结构支持的双重作用。既往研究已证实该冷冻保存eUTA在不同供体间高度一致，其蛋白悬液亦被详细表征：蛋白质组学显示其富含纤维状胶原与基质糖蛋白及与组织修复、氧化保护和能量稳态相关的蛋白；免疫分析显示炎性细胞因子水平低，并存在趋化因子、血管生成因子和透明质酸等营养介质，以及以白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）和白细胞介素-10（IL-10）为特征的低炎性谱。然而，关于eUTA支架的物理形态及其相关囊泡如何决定这些蛋白在损伤组织内的递送、微粒的微纳结构如何影响细胞黏附、浸润和重塑、生物降解特性如何决定蛋白释放时相与力学支持持续时间，以及eUTA内是否存在可提供额外旁分泌信号的细胞外囊泡（EVs）等问题尚待阐明。因此，本研究旨在超越蛋白成分编目，从显微结构、生物降解和EVs三个层面阐明eUTA作为动态生物活性支架的行为机制。研究假设为：eUTA微粒会随时间自然降解并可被可控酶解，导致基质蛋白和信号蛋白逐步释放；该降解特征与明确的显微结构及相关EVs共同支持其作为马肌肉骨骼组织促修复支架的功能。

**关键技术方法** 本研究为体外互补性显微与生化研究。eUTA来源为Equicenta?CTM（Equine Performance Labs，Austin，TX），取自受控的纯血马群中足月自然分娩的健壮马驹，对母马和马驹无伤害，使用前室温解冻。实验1：将新鲜解冻eUTA置于含10%胎牛血清的DMEM中培养至两周，分别设未消化、胶原酶I（50 U/mL，来源Clostridium histolyticum）消化1小时和0.25%胰蛋白酶消化30分钟组，行相差显微镜观察。实验2：将eUTA离心沉淀后直接涂片，冷丙酮与甲醇1:1固定、苏木素染色后镜检。实验3：取5个不同供体的eUTA，与生理盐水、胶原酶I（100 U/mL）或0.25%胰蛋白酶按1:1比例于37℃孵育，在30分钟、2小时和24小时进行显微观察，并以Bradford法测总蛋白、ELISA测TIMP-2与COL1A1。实验4：取10个不同供体样本，在Triton X-100提取前后以马特异性多重ELISA检测炎性、合成代谢和抗分解代谢介质。实验5：取11个供体eUTA，经差速超速离心分离EVs，采用NanoView ExoView?平台进行单颗粒粒径、计数及CD9、CD63、CD81、CD90、CD105标志物分析，并行质谱蛋白质组学检测胞质标志物。数据分析采用混合效应模型（治疗、时间及交互为固定效应，供体为随机效应）、Tukey事后检验及配对t检验，p<0.05为差异显著。

**研究结果**

eUTA在生物相容性培养基及沉淀涂片中的显微评估 相差显微镜显示eUTA在含胎牛血清培养基中保持完整支架样结构，未消化组形成大的细胞外基质聚集体，不贴壁而漂浮于培养基中；胶原酶消化1小时后聚集体变小变少，提示部分胶原消化；胰蛋白酶处理30分钟后几乎完全消化，仅余少量颗粒聚集体；两种酶消化后的基质均不贴壁，且在含10%胎牛血清的培养基中于37℃维持数周未见进一步降解。沉淀涂片苏木素染色显示纤维状、丝状细胞外基质具有明显的网样结构。

eUTA生物学降解与酶消化 在37℃生理盐水、胶原酶或胰蛋白酶中，eUTA的丝状物数量、大小和网络结构及总蛋白随时间减少，其中生理盐水组颗粒降解最少；所有组总蛋白浓度随时间显著下降（p<0.001）。胶原酶消化迅速溶解COL1A1，2小时和24小时浓度分别显著升高至197.7±174.6和750.3±673.2，而生理盐水或胰蛋白酶组几乎检测不到（p<0.001）。孵育30分钟时，胶原酶组（1078±158.4 ng/mL）和胰蛋白酶组（1476.6±158.4 ng/mL）TIMP-2显著高于生理盐水组（443±158.4 ng/mL）（p<0.05），2小时时进一步升高，24小时后均不可检测。

eUTA去垢剂提取后的生物介质 总体上抗分解代谢指数（p<0.001）和合成代谢指数（p=0.025）在提取后显著高于提取前。具体而言，α-2巨球蛋白（A2M；p=0.004）和TIMP-2（p=0.018）提取后分别增加2.7倍和3.5倍，IGF-1（p=0.025）增加2.3倍。抗炎生物介质及其指数在eUTA中水平较低，且提取后降低（p=0.019），提示这些细胞因子可能为可溶性而非基质结合型；IL-1Ra在抗炎细胞因子中提取前浓度最高（269.9±0.18 pg/mL，p=0.017）。促炎细胞因子水平低且提取后下降（p=0.028），提示eUTA不携带炎性细胞因子。

eUTA细胞外囊泡分离与表征 EV分析证实平均为9.28×10¹¹±2.2×10¹⁰个囊泡/mL，平均粒径133.98±0.7 nm。CD9捕获探针所得颗粒数为10⁸–10⁹个/mL，远高于同型对照；CD81亦大量检出。总体63%颗粒与CD9荧光抗体共定位，11.6%与CD81共定位，22.1%同时与CD9和CD81共定位。尽管CD63直接荧光抗体对马不具特异性，ExoView芯片上的CD63捕获探针仍能有效结合样本囊泡且高于同型对照，CD63捕获的EVs亦与CD9、CD81荧光抗体共定位。间充质细胞标志物CD90和CD105在少量（<5%）捕获囊泡中与CD9、CD81和CD63捕获探针共定位。EV样本蛋白质组学显示胞质蛋白ALIX高丰度表达。

**讨论与结论** 本研究首次证明该eUTA由含可溶性和细胞外基质蛋白的生物性丝状网样支架构成，可在体内作为内源性细胞迁移的结构框架并随时间释放促修复蛋白。显微评估证实微粒倾向聚集，相差成像显示凝胶样基质样团簇，与其他市售微加工华通胶（Wharton's jelly）同种异体移植物报道相似。细菌胶原酶部分降解生物支架使团簇减少、聚集体变小，与富含胶原的华通胶基质降解一致；尽管细菌胶原酶与内源性哺乳动物胶原酶在底物特异性和酶活性上不同，但结果表明基质易受胶原酶性降解，提示损伤组织内内源性蛋白水解酶可能参与eUTA的体内自然重塑与生物降解。0.25%胰蛋白酶消化产生最少聚集，符合其较胶原酶更广泛的基质降解。24小时胶原酶和胰蛋白酶消化降低总蛋白浓度，进一步提示eUTA蛋白可被酶解；胶原酶特异性促进基质结合胶原片段的释放与溶解，表现为COL1A1浓度随时间持续升高；单纯37℃生理盐水也引起降解，可能通过水解、基质机械弱化及内在酶活性。30分钟和2小时酶暴露增加TIMP-2浓度，提示该因子从基质释放；Triton X-100提取后IGF-1、TGF-β、TIMP-1和A2M浓度升高，与华通胶作为基质结合生物活性蛋白储库的既往报道一致。作者指出Triton X-100为非生理性去垢剂，仅作为生化提取工具，用以判断eUTA是否含可在组织重塑中利用的基质相关生物活性因子，而非模拟特定体内降解机制。研究还指出华通胶是肽类生长因子公认来源，其生长因子被认为与高分子量细胞外基质成分紧密结合；eUTA的细胞因子与生长因子谱（含TIMP-1、TIMP-2、bFGF、VEGF和IGF-1）与其他人围产期来源ECM产品相当。合成代谢介质中，bFGF（软骨细胞促分裂原）可稳定检出，提取前浓度较高，与或超过富血小板血浆（PRP）和骨髓抽吸物等成人自体生物制剂。IL-1Ra浓度低于自体条件血清，可能反映组织来源和加工差异，但既往报道eUTA关节内注射可引起IL-1Ra显著升高及IL-1Ra:IL-1比值持续升高超过3周。综上，eUTA可作为生物活性因子储库，随基质降解逐步释放，提高局部微环境中关键调控分子的生物利用度。ExoView分析在多个供体eUTA中鉴定出数百亿至数万亿个130–134 nm范围的EVs，符合小EVs包括外泌体；这些囊泡表达经典外泌体标志物（CD9、CD63、CD81）并含胞质蛋白ALIX，确认其外泌体身份，部分表达MSC相关标志物CD90和/或CD105，支持加工后eUTA内存在基质结合纳米囊泡。研究局限性包括部分显微评估为定性性质，且体外模型无法完全再现体内马环境的复杂性或损伤组织中的蛋白水解过程谱；但未消化与消化产品间存在清晰一致的差异，细胞因子、生长因子和EV数据共同描绘出eUTA作为生物活性细胞外基质支架的图景。作者结论指出：本研究所评估的eUTA通过提供生物性细胞外基质展现出关键生物材料特性，该基质可提供结构支持并作为信号分子储库，可能在骨科损伤中促进组织愈合；这些特性可能增强内源性修复过程并改善马肌肉骨骼损伤的结局。