《Applied Materials Today》：Modular two-photon polymerized microfluidics for on-chip synthesis and functionalization of nanogels for ovarian cancer drug delivery
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纳米颗粒（NPs）因能够穿越系统循环、组织微环境及细胞膜等多重生物屏障，克服游离治疗药物在生物利用度、控释与靶向效率方面的局限，在纳米医学中备受关注。其中，主动靶向通过在纳米颗粒表面偶联配体实现与特定受体的选择性结合，可提高药物递送的精准性与有效性，但传统上多
纳米颗粒（NPs）因能够穿越系统循环、组织微环境及细胞膜等多重生物屏障，克服游离治疗药物在生物利用度、控释与靶向效率方面的局限，在纳米医学中备受关注。其中，主动靶向通过在纳米颗粒表面偶联配体实现与特定受体的选择性结合，可提高药物递送的精准性与有效性，但传统上多采用基于间歇（batch）的乳液或分散介导方法进行功能化，往往存在重复性有限、批次间差异大及配体密度不均等问题，尤其当使用抑制性分子或肽类靶向基元时，功能化的不均匀会直接影响受体结合效率、多价相互作用及系统生物学性能。微流控（microfluidics）技术可精确调控流体动力学、传质与反应条件，减少试剂消耗并提升过程效率，但将其用于纳米颗粒表面受控修饰仍研究不足。常规微流控器件多依赖软光刻（soft lithography）、聚二甲基硅氧烷（PDMS）模塑及数控微加工等间接或多步工艺，分辨率与灵活性有限。双光子聚合（2PP）3D打印作为一种增材制造技术，可为复杂微纳结构提供高精度与高分辨率。基于此，研究人员提出构建模块化2PP打印微流控平台，用于纳米凝胶（NGs）的连续合成与流内（in-flow）功能化。该平台由三个互联单元组成：用于试剂受控混合的微混合器（micromixer）、用于纳米载体合成的微液滴发生器（microdroplet generator）以及作为专用修饰模块的微注射器（microinjector），后者可将靶向分子直接偶联到预形成的纳米颗粒上。研究人员以透明质酸（HA）与聚乙二醇（PEG）为反应性聚合物，在作为离散反应腔室的微液滴内完成聚合物化学交联，随后在流内以针对卵巢癌治疗开发的抑制剂进行表面修饰，并与传统间歇功能化进行直接比较，结果显示在完整微流控装置下接枝效率提高约20%。在负载顺铂（cisplatin）后，所修饰NGs在OVCAR3卵巢癌细胞中证实了其作为药物递送系统的潜力，所获结果表明修饰NGs的治疗效果，并证实该微流控平台不仅适用于纳米颗粒合成，也适用于在单一集成工作流内实现其受控表面修饰。
**一、研究背景与问题**
纳米颗粒（NPs）能穿越系统循环、组织微环境和细胞膜等多重生物屏障，从而克服游离治疗药物在生物利用度、控释和靶向效率方面的局限，因此在纳米医学中备受关注。靶向策略主要通过被动（如增强渗透与滞留效应，EPR）或主动机制实现，后者依赖将抗体、抑制性分子或肽等配体偶联于纳米颗粒表面，以选择性结合特定受体。然而，聚合物纳米颗粒的常规功能化多采用乳液或分散介导的间歇（batch）方法，包括合成后孵育、配体吸附或在本体条件下进行偶联反应，普遍存在重复性有限、批次间差异大等问题；最终理化与功能性质对浓度梯度、混合效率及聚合物–配体偶联等参数高度敏感。间歇功能化还可能导致装饰剂在单个颗粒间分布不均，造成配体密度、表面覆盖度和粒径分布的差异，这在以抑制性分子或肽为靶向基元时尤为关键，因为不均匀功能化会直接影响受体结合效率、多价相互作用及系统生物学性能。微流控技术可精确控制流体动力学、传质和反应条件，减少试剂消耗并提升效率，基于液滴的微流控在聚合物纳米颗粒与NGs合成中已被验证，液滴作为受限微反应器可实现高度可控的物理组装或化学反应。但微流控用于纳米颗粒与NGs受控表面装饰仍研究不足；将合成与装饰整合于单一连续流平台，有望更严格控制反应条件、减少中间处理步骤、提高批次间重复性并获得更均匀的配体接枝。此外，常规微流控器件多通过软光刻（如聚二甲基硅氧烷（PDMS）从光刻母模成型）、数控微加工和层压制造，依赖间接或多步流程或减材制造，分辨率与灵活性有限，且需专用设施和严格受控环境，易受操作者差异影响，导致制造失败且材料或器件回收机会有限，影响整体效率与可扩展性。双光子聚合（2PP）3D打印作为增材制造技术，可为复杂几何构型的微米与纳米结构提供高精度与高分辨率。研究人员此前已探索该技术开发微流控器件的可行性，证明其相较常规方法具有更直接的设计到制造路径。基于此概念验证，本研究提出采用2PP 3D打印构建模块化微流控平台，以应对纳米颗粒高效、可重复表面装饰的挑战。
**二、研究内容与结论**
研究人员设计并制造了由三个互联微流控单元组成的模块化平台，均具高分辨率通道，实现纳米颗粒的连续合成及后续流内功能化：(i) 微混合器，用于纳米颗粒形成所需试剂的受控混合；(ii) 微液滴发生器，用于纳米载体合成；(iii) 微注射器，作为专用装饰模块，将靶向分子直接偶联至预形成的纳米颗粒。研究人员以NGs（一类软质聚合物纳米颗粒，因可调理化性质和高载药能力在肿瘤相关应用中备受关注）的合成与表面装饰验证该系统的可行性，采用透明质酸和聚乙二醇作为NG形成的反应性聚合物，在作为离散反应腔室的微液滴内完成聚合物化学交联，随后在流内以针对卵巢癌治疗前期开发的抑制剂进行表面装饰。为评估该方法的优势，研究人员将流内装饰过程与常规间歇功能化直接比较，发现在使用完整微流控装置时对接枝效率的控制更优（约提高20%）。负载顺铂后，装饰NGs在OVCAR3卵巢癌细胞中评估，证实其作为药物递送系统的潜力；结果凸显装饰NGs的治疗效果，并证实该微流控平台不仅适用于纳米颗粒合成，也适用于在单一集成工作流内实现其受控表面修饰。
**三、主要关键技术方法**
研究采用双光子聚合（2PP）3D打印（Quantum X Shape打印机，浸没模式）制造三个模块化微流控单元，并以计算流体动力学（CFD，COMSOL Multiphysics）模拟优化微混合器几何；通过扩散序谱核磁共振（DOSY-NMR）测定聚合物扩散系数。纳米凝胶采用液滴微流控合成，并与水包油（W/O）乳液间歇合成对照。表征手段包括核磁共振氢谱（1H-NMR）、衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）、动态与电泳光散射（DLS/ELS）、透射电镜（TEM）、高效液相色谱（HPLC）及紫外–可见分光光度法。细胞实验采用OVCAR3人卵巢癌细胞系（ATCC? HTB-161?），以MTT法和Live/Dead法评价。
**四、研究结果**
3.1 2PP制造微流控单元与CFD模拟：2PP 3D打印忠实复现设计几何，实现含圆形截面通道的三维微流控结构，单步直接写入，后处理仅需去除未聚合树脂。经CFD模拟，混合单元（MU）超过16个后混合效率无显著提升，故选用MU = 16；微液滴发生器采用流动聚焦结，可在较高流速下稳定生成液滴；装饰器–微注射器在正交注射通道交汇处引入局部通道截面收缩，增强局部剪切与液滴瞬态变形，G构型另设阶梯式收缩以延长装饰区停留时间。器件小型化降低光刻胶消耗与制造时间，模块化设计支持灵活互连。
3.2 Tesla型微混合器验证：以HA-Cy5与未标记PEG为两相，在20 μL/min流速下出口平均荧光值为0.49，证实MU = 16时达到最佳混合水平，与CFD结果一致。
3.3 微流控合成NGs的理化表征：水相流速固定20 μL/min，油相流速在70–150 μL/min间变化。90–120 μL/min时液滴尺寸均匀，更高流速转入喷射（jetting）区导致多分散性显著上升。1H-NMR未见咪唑芳香质子残留峰，表明交联成功；ATR-FTIR确认NG形成。DLS显示连续相流速增至100 μL/min时流体力学直径（DH）最大降低约80%，超过后DH回升且变异增大，归因于液滴内体积受限与聚合物链位阻。综合细胞摄取需求与PDI，选取90 μL/min（NG 90，DH = 118.3 nm，PDI约0.06）用于后续实验；ζ电位为负，反映透明质酸的阴离子性质。
3.4 间歇合成NGs的理化表征：间歇法NGs PEG:HA摩尔比为2.1:1，DH = 232.7 nm，PDI = 0.24，ζ电位?23.9 mV，表明间歇乳化对液滴形成与界面相互作用控制不足，导致颗粒更大且更分散；微流控法可获得间歇法无法达到的尺寸与单分散性。
3.5 NG装饰：比较半间歇（S）与两种微注射器（P、G）流内装饰。G构型接枝密度（GD）较S和P分别提高约1.2倍和1.6倍，归因于通道局部阶梯收缩诱导液滴瞬态伸长与收缩，增大界面接触面积与停留时间。装饰后NG尺寸增大，G样品DH增幅最大且GD最高。
3.6 装饰NGs的载药与释放：各装饰配方载药量（DL%）相近，NG P包封率（EE%）略高。NG S与NG P 14天释放约51%与55%，NG G超过70%。所有样品呈两段释放，转变约在144 h，前期为近外层药物扩散，后期为内部结构中药物的缓慢扩散。
3.7 NG介导药物释放的细胞实验：NG 90在0.5 mg/mL以内无显著细胞毒性，故选用0.1 mg/mL。WRG-B接枝使细胞活力最高降低75%（NG G，24 h），与GD值一致（NG P vs NG S：p < 0.05；NG P vs NG G：p < 0.01）。载药装饰NGs较游离顺铂（降低约40%）进一步降低活力约20%；Live/Dead实验显示载药装饰NGs处理组活细胞显著减少（NG P + Drug：p < 0.01；NG S + Drug与NG G + Drug：p < 0.0001）。结果表明表面功能化实现接枝基元内在活性与载药控释的协同治疗效果。研究人员亦指出，2PP激光逐点写入本质上的串行性可能限制制造通量并增加时间与成本，但多焦点写入与共振扫描等进展正逐步改善。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，微注射器通道几何可调控停留时间与界面接触，流动聚焦结较T形结构可在更高流速下稳定生成液滴并降低堵塞风险；药物释放差异与NG尺寸、WRG接枝密度及聚合物网络中游离羧基可用性相关。结论译文：本工作提出了通过2PP 3D打印设计并制造模块化微流控平台，并验证其基于液滴微流控原理用于NGs连续流内合成与功能化。该系统由相互连接的模块序列构成，实现连续工作流：聚合物前体首先在Tesla型微混合器中均化，随后在微液滴发生器中形成NGs，并在专用模块中进行芯片上表面功能化。该模块化配置可精确控制每一步骤，包括独立注射聚合物前体和功能化试剂，最终实现从原料直接回收完全合成并装饰的纳米支架。2PP 3D打印的使用使紧凑、高分辨率且机械稳定的微流控单元得以制造，并可轻松互连为多组件系统，确保高设计灵活性、结构稳定性和可重复的微尺度特征。在此框架下，微流控方法的关键创新在于通过化学偶联实现NGs的芯片上装饰，该策略可将功能分子直接、可控且可重复地接枝于纳米支架。此外，微流控功能化显示出与常规半间歇方法相当或更高的接枝密度，凸显其作为纳米颗粒装饰策略的有效性。以WRG-B为模型分子，装饰NGs保持低多分散性和适宜的理化性质，并在载药后表现出进一步增强的治疗活性，证实其作为功能性纳米支架和药物递送系统的双重作用。总体而言，本工作表明模块化2PP制造微流控平台是受控生产与功能化聚合物纳米材料的有力且通用的方法，将合成与定制装饰整合于连续微流控工作流，为开发可重复、可定制的纳米治疗系统提供了坚实基础，凸显该技术在先进生物应用中的潜力。
