适应性进化揭示益生菌及肠道来源大肠杆菌中草酸盐利用的候选遗传路径

《Cell Reports Methods》：Adaptive evolution identifies candidate genetic routes associated with oxalate utilization in probiotic and gut-derived E.coli

　　

摘要 动机：工程化益生菌执行特定代谢功能通常依赖异源通路，这可能需要多基因构建，且难以明确所需活性是否可通过适应细菌基因组中已编码的功能来实现。研究人员寻求一种互补策略，利用适应性实验室进化（adaptive laboratory evolution, ALE）来挖掘益生菌及肠道来源细菌底盘中的潜在代谢能力。以草酸盐利用作为严格的模型表型，研究人员检验ALE能否在生成功能性菌株的同时，识别出可供下游机制研究的重复性候选遗传路径。该框架拓展了开发代谢功能性益生菌的工具箱。 亮点： • ALE使益生菌及肠道来源的E. coli进化出草酸盐利用能力 • 进化菌株在微需氧条件下消耗胞外草酸盐 • 重复出现的adhE和eut突变识别出候选遗传路径 • ALE揭示了益生菌细菌底盘中的潜在代谢能力 总结：功能性益生菌为降解肠道内疾病相关化合物提供了一种治疗模式。在高草酸尿症中，基于天然草酸盐降解菌（如Oxalobacter formigenes）的治疗策略显示出疗效不一，这促使研究人员开发方法以扩展草酸盐利用细菌底盘的种类，并探索该功能得以进化的天然遗传路径。在此，研究人员在微需氧条件下使用适应性实验室进化（ALE），使益生菌Escherichia coli Nissle 1917（EcN）及三株肠道来源的E. coli分离株获得草酸盐利用能力。在约400代内，所有进化系均在以草酸盐为唯一碳源和能源的极限培养基上实现稳健生长。重复出现的突变识别出天然醛脱氢酶相关模块，包括AdhE和Eut系统，作为与进化获得的草酸盐利用相关的候选遗传路径。研究人员提出，ALE是一种可扩展的框架，可用于挖掘益生菌及肠道相关细菌中的潜在代谢能力，并生成可用于后续功能验证的、机制上可操作的候选菌株。

论文解读：适应性进化揭示益生菌及肠道来源大肠杆菌中草酸盐利用的候选遗传路径

一、研究背景与科学问题

肠道微生物代谢日益被认为是人类疾病发生、发展及治疗响应的重要驱动因素和调节因子。“功能性益生菌”被设计用于执行特定的代谢任务，因此提供了一种颇具吸引力的治疗模式。然而，依赖天然存在的降解菌的策略面临转化障碍，常受限于宿主不相容性、生产限制和监管复杂性。一种有吸引力的替代方案是从临床可信赖的益生菌出发，利用适应性实验室进化（adaptive laboratory evolution, ALE）在模拟肠道条件（如温度、气氛和pH）下赋予这些菌株新的代谢功能。

肾结石疾病是活菌治疗剂的常见靶点，因为大多数结石由内源性产生和饮食摄入的草酸盐构成。肠道中草酸盐降解菌（如Oxalobacter formigenes）的存在与尿草酸盐降低和结石风险降低相关。尽管O. formigenes是专性草酸盐降解菌并已进入临床评估，但人体研究显示其对尿草酸盐的影响具有情境依赖性，在不同疾病和健康成人队列中反应不一。近期研究表明，这种变异性受更广泛的驻留微生物组影响：草酸盐代谢可分布于多种草酸盐降解菌群中，且草酸盐降解菌或基因的基线丰度可影响对O. formigenes给药的响应。这些发现共同推动了开发补充性方法，以扩展草酸盐利用细菌底盘的种类，并识别该代谢功能得以进化的遗传路径。

合成生物学方法已证明益生菌Escherichia coli Nissle 1917（EcN）可通过安装异源通路被编程以降解或消耗过量有害代谢物。对于草酸盐，同一底盘已被工程化以表达O. formigenes基因（oxlT、oxcD和frc）及S. cerevisiae酶（ScAAE3），证明了可行性，但需要多基因插入并确保插入基因in vivo的协调表达。与其引入专门的草酸盐模块，研究人员提出一个更根本的问题：草酸盐利用能否直接从E. coli的天然基因库中进化而来。与这一“天然基因”前提一致，在已表征的微生物草酸盐通路中，Cupriavidus oxalaticus途径（BioCyc: PWY-6696）与E. coli直系同源基因的重叠最大。然而，典型E. coli缺乏专用的乙醛酸脱氢酶，草酸盐相关基因被注释为介导草酸盐诱导的应激反应，而非支持以草酸盐为碳源和能源的净生长。这些观察表明存在一个功能性缺口，进化可能通过重新利用内源脱氢酶活性来弥合。

二、研究内容与主要结论

研究人员在微需氧条件下对四株E. coli分离株（三株来自健康志愿者粪便的肠道分离株Ec1–Ec3，以及益生菌EcN）进行ALE，以选择草酸盐利用能力。经过约400代（60次传代，4个月），所有四个群体均在以草酸盐为唯一碳源和能源的极限培养基上实现稳健生长，且进化群体在无草酸盐条件下未表现出适应性代价。全基因组测序识别出33个突变，其中近半数映射到三个位点：eutE、eutN和adhE。在草酸盐利用菌落中，90%携带adhE或乙醇胺利用（eut）操纵子（特别是eutE或eutN）的突变，且没有分离株同时携带两个模块的突变，提示这些路径可能是同一选择表型的替代解决方案。进化动力学分析显示，携带adhE或eut突变的谱系在草酸盐-only选择期间扩张并成为优势群体，与两条候选进化路径一致。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下主要技术方法：（1）适应性实验室进化（ALE），在微需氧条件下（氧浓度维持在约1,000–10,000 ppm）对四株E. coli分离株进行连续传代培养，初始培养基含0.05%甘油和0.2%草酸盐，待草酸盐-only平板上出现菌落后移除甘油；（2）全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）及突变分析，对每个进化群体的9–14个菌落进行测序，以各祖先菌株的de novo组装基因组为参考进行变异鉴定；（3）Muller图进化动力学分析，使用R语言的ggmuller包可视化60次连续传代中的谱系动态；（4）蛋白质结构分析，使用PyMOL将突变映射到EutN（PDB: 2Z9H）、AdhE（PDB: 6AHC）和异柠檬酸脱氢酶（PDB: 1AI3）的晶体结构上；（5）EutE封装实验，将野生型及突变型信号肽与GFP-SsrA融合，通过流式细胞术和荧光显微镜定量微区室封装效率；（6）重组蛋白表达纯化及酶活性测定，在E. coli BL21(DE3)中表达His₆标记的AdhE变体，监测NADH生成以测定乙醇和乙醛脱氢酶活性。菌株来源方面，Ec1–Ec3来自Poyet等人2019年描述的人类肠道细菌分离株库，EcN由Ardeypharm GmbH提供。

四、主要研究结果

EutE信号序列突变将酶重新靶向至细胞质：在两条进化系中，研究人员发现EutE N端微区室靶向序列内的取代——Ec3中的V10L和Ec2中的L14Q。通过将GFP与这些突变信号序列融合的封装实验，两种取代均将EutE定位从微区室转移至细胞质。相对于天然信号序列（ssEutE），ssEutE(V10L)和ssEutE(L14Q)均显示封装效率显著降低，与细胞质重新定位一致。

EutN孔道衬里突变提示微区室通透性改变：所有EutN进化取代均映射到孔道朝向残基：V58L（在Ec2和Ec3中独立出现）、G60V（Ec3）和A63T（EcN）。这些变化可能改变孔道通透性或细胞质与微区室之间的代谢物交换，可能影响草酸盐或草酸盐衍生中间体对区室化Eut相关酶的访问。eutN和eutE的平行突变支持Eut相关功能通过酶定位改变或微区室交换改变对进化获得的草酸盐利用有所贡献的模型。

AdhE突变聚集在醇结合裂隙和活性位点附近，并预测启动子上调：AdhE包含AldDH结构域与醇脱氢酶（ADH）结构域的融合。所有编码区变化均映射到ADH区域：Y77H位于结构域间界面，F583L、Y581C和F837L侧翼于醇结合裂隙，G546D和G600D位于ADH催化中心附近。在EcN中，还检测到adhE 5′ UTR中的三个点突变，启动子建模预测表达增加，包括一个增强起始密码子上游132 bp处?10元件的变体。

突变AdhE保留天然底物但体外乙醇活性增强：纯化的AdhE变体氧化乙醇和乙醛，突变体对乙醇的活性高于野生型，表现为较低的表观K_M。在测定条件下未检测到对乙醛酸、乙醇酸或草酸盐的活性。辅因子使用仍特异于NAD⁺，添加进化期间使用的金属混合物未改变底物范围。这些数据表明进化AdhE变体保留天然活性并改变对乙醇的活性，但未建立对草酸盐或草酸盐衍生中间体的活性。

五、讨论与结论

研究人员提出一个假设模型：进化获得的草酸盐利用可能涉及与C. oxalaticus途径（BioCyc: PWY-6696）类似的反应。E. coli编码YfdU，一种预测生成草酰-CoA的甲酰-CoA转移酶，yfdU位于eutE上游约77 kb处。在该模型中，进化获得的AdhE或EutE相关功能可能贡献于缺失的脱氢酶相关步骤，将草酸盐衍生中间体连接到乙醛酸代谢。从乙醛酸出发，碳可通过乙醛酸支路被同化并耦合能量生成。与此一致，研究人员还观察到异柠檬酸脱氢酶（icdE）和乙醛酸支路阻遏物iclR的突变，提示乙醛酸支路的调控或通量改变可能有助于草酸盐生长。然而，该通路仍是假设性的。

关于体内应用，尽管ALE方案旨在重现肠道相关参数，但草酸盐利用的选择是在草酸盐作为唯一碳源和能源的碳限制条件下强制实施的，这与营养丰富的肠道环境根本不同。一种实际缓解措施是在给药前通过在草酸盐选择条件下培养来预启动细胞。另一种补充策略是利用ALE识别的候选位点作为未来工程化的起点，以实现组成型或肠道响应型表达。

本研究的一个核心局限是草酸盐利用的遗传和生化机制仍未解决。研究人员未在祖先背景中重建进化的adhE或eutE/eutN等位基因，未在进化菌株中回复这些突变，也未进行敲除/互补实验以测试必要性和充分性。因此，尽管突变的趋同性、互斥性、在携带少量检测突变分离株中的出现以及时间分辨的扩张强烈关联adhE和eut与进化获得的草酸盐利用，但并未建立等位基因水平的因果关系。未来在EcN中的重建和回复实验对于确定这些突变是否充分、必要或依赖于额外进化变化至关重要。

研究结论：ALE在约400代内使四株遗传分化的肠道相关E. coli分离株快速获得以草酸盐为唯一碳源和能源的生长能力，并伴随终点胞外草酸盐消耗。进化结果强烈提示两个醛脱氢酶相关模块——AdhE和Eut系统——作为与该表型相关的重复路径。应用ALE生成表型表征菌株并优先排序候选遗传位点，为后续机制和转化评估提供了补充策略和起点。