沙雷氏菌质粒谱系中一种趋异候选FII相关复制子的计算机预测

《Current Issues in Molecular Biology》：In Silico Prediction of a Divergent Candidate FII-Related Replicon Among the Serratia Plasmid Lineage

　　

：复制区（replicon）是质粒中控制其复制并进而决定其存在的最重要模块。目前，大量具有不同结构的复制子类型已被鉴定，成为质粒分类和复制子分型的基础。尽管针对质粒复制装置的研究持续开展，仍有部分质粒无法通过复制系统加以鉴定。研究人员对沙雷氏菌属（Serratia）质粒中50个无法分型或经复制系统鉴定结果相互矛盾的复制子进行了研究。这些复制子共享一个可能编码复制起始蛋白（RepA）的新基因，但观察到典型的FII和FIC复制子中copA与copB基因的排列方式存在差异。比较基因组学和系统发育分析揭示了它们可能从FII型演化而来的新见解。基于上述结果，研究人员提出在沙雷氏菌质粒中存在一种趋异的候选FII相关复制子类型。所得发现通过演化一般模型的两个阶段视角进行了讨论。该结果为基于复制系统的质粒分类、质粒复制子演化及细菌质粒分型提供了新见解。

论文解读：沙雷氏菌质粒中趋异候选FII相关复制子的计算机预测研究

一、研究背景与问题

质粒是细菌中自主复制的遗传元件，其演化驱动着细菌宿主的演化，为细菌提供独特的环境适应性并使其能够占据新的生态位。质粒具有模块化结构，其中复制模块即复制子（replicon）发挥着关键作用。典型的质粒复制子包含复制起点（含复制起始位点），多数情况下还包含编码复制起始蛋白（Rep/RepA）的基因。此外，复制子几乎总是编码调控元件、蛋白质和/或非编码（反义）RNA，以控制质粒拷贝数。目前，对质粒复制子的积累知识已使分类基础从质粒不相容性（Inc）发展到下一层次——复制子分型。复制子质粒分型通过多种在线工具完成，包括Plasmid MLST数据库。FII型复制子是最广泛使用的质粒类型之一，其复制子序列分型（RST）基于包含copA区域的DNA片段。经典FII型复制子由repA基因、tap基因（编码RepA的前导肽Tap）、copA（负调控repA翻译的反义RNA）和copB基因（编码抑制repA启动子的转录抑制因子CopB）组成，此外还包含复制起始位点和两个复制终止位点（Ter位点）。

尽管在理解质粒复制子结构方面取得了显著进展，但许多质粒仍无法被鉴定。质粒分型因其多样性和动态性而仍然是一个困难挑战。沙雷氏菌属的基于复制子的质粒分型也不例外。近期研究显示，在132个沙雷氏菌质粒中，24个通过各种分型工具仍无法被复制子鉴定。对沙雷氏菌质粒pSM22复制子的研究也显示其与典型FII型存在显著差异。关注沙雷氏菌质粒的原因在于它们在抗生素耐药性传播中的介导作用，特别是携带bla_TEM-61、bla_IMI-22、bla_IMI-23、bla_KPC-2和bla_GES-5等耐药基因。因此，本研究旨在通过计算机手段初步探索沙雷氏菌质粒复制子的演化，以填补其复制子相关知识的空白。

二、研究内容与结论

研究人员对50个沙雷氏菌谱系质粒复制子进行了分析，这些复制子通过Plasmid MLST数据库无法鉴定或被归属为FII或FIC型。通过比较基因组学和系统发育分析，研究人员提出了一种趋异的候选FII相关复制子类型，并追踪了它们在沙雷氏菌质粒谱系中的还原性演化。研究表明这些复制子可能从FII型演化而来，FII型为其他沙雷氏菌质粒所固有。该研究为质粒分类、复制子演化和细菌质粒分型提供了新见解。

三、主要技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：利用NCBI Nucleotide数据库获取质粒和基因组的完整核苷酸序列（gb文件），通过Plasmid MLST数据库进行初始鉴定；采用ORFfinder和SnapGene Viewer进行开放阅读框（ORF）预测，利用NCBI BLASTp针对UniProtKB/Swiss-Prot数据库进行注释，通过NLM保守结构域数据库（CDD）分析保守结构域；以pSM22质粒复制子序列为模板进行BLASTn同源性搜索；使用Easyfig软件进行复制子间的比较基因组分析并计算BLASTn一致性；采用ClustalW和MUSCLE进行多序列比对，利用MEGA7软件基于JTT矩阵模型的最大似然法（ML）进行系统发育分析；使用SIAS工具计算序列一致性和相似性值，WebLogo用于序列保守性可视化。

四、研究结果

4.1 质粒与复制子

基于与pSM22质粒复制子核苷酸序列的一致性，研究人员构建了包含所分析复制子的质粒数据集。共鉴定出76个质粒（含pSM22质粒）携带相关复制子。其中29个复制子来自未命名质粒，这些质粒分离自Serratia marcescens subsp. marcescens ATCC 13880的细菌克隆，长度差异仅为1至4个核苷酸，表明它们是相同的质粒，因此仅选择一个代表进行进一步分析。此外，在Serratia marcescens AS1基因组中发现一个复制子。质粒pPWN146.1含有两个复制子。最终共有50个复制子序列纳入分析。所有复制子均来自沙雷氏菌属质粒，其中Serratia marcescens占主导。四个质粒（pSM22、unnamed、pATCC和unnamed）共享99.92%至100%的一致性，构成pSM22样质粒谱系。所有49个分析质粒的大小范围为43,151至204,933 bp。

4.2 Plasmid MLST分型

通过Plasmid MLST数据库进行两步鉴定策略：首先分析完整序列，然后分析去除推定复制子后的序列。大多数质粒（16个）未被鉴定，而相当一部分（15个）被鉴定为FII复制子型。在双复制子质粒pPWN146.1中，一个复制子被鉴定为FII型，而第二个未被鉴定。三个质粒含有FIC型复制子。14个质粒携带vapBC: 7等位基因和来自S. marcescens AS1基因组的复制子，由于vapBC: 7等位基因与复制无关，这些质粒被归类为未鉴定。值得注意的是，从质粒序列中去除潜在复制子序列后，质粒无法被鉴定，这证实了这些序列是质粒的复制子且对其鉴定至关重要。因此，所研究的质粒谱系在Plasmid MLST鉴定中显示出矛盾结果。

4.3 复制子的比较基因组分析

推定复制子区域的5′端两侧为tra模块基因（特别是traI和traX），与模型质粒pSM22相似。3′端两侧为不同的货物模块基因。所有复制子均表现出位于两个质粒模块之间的位置模式和完整的结构保守性。比较基因组分析显示，25个携带copB基因的复制子（50%）彼此分组，并与模型质粒pNDM_12TM的复制子分组。其余25个不含copB基因的复制子（50%）分组如下：质粒pE05的复制子在5′端有一个长片段且不含copB基因ORF，被置于两组沙雷氏菌质粒复制子之间。分析显示，沙雷氏菌质粒复制子与FII和FIC型参考复制子之间存在大范围共享一致性区域（69%至100%）。编码RepA蛋白的区域与FII复制子无一致性，而邻近区域则表现出高度一致性。所有沙雷氏菌复制子在编码推定RepA蛋白的区域及其3′端邻近区域共享高水平一致性。25个含copB质粒的复制子中，推定repA基因5′端侧翼区域不仅彼此之间高度一致，而且与FII和FIC复制子的相应区域也高度一致。质粒pE05复制子与含copB的质粒pSMBC31-93K和pSM22复制子均显示出高度一致性区域，pE05复制子包含与copB基因3′端一致的部分序列，而该基因的5′端缺失。

4.4 复制起始蛋白RepA

大多数已鉴定复制子含有一个948 bp的ORF，方向与FII和FIC复制起始蛋白相同。质粒pPWN146.1和pPWN146.2的两个ORF分别为837 bp和735 bp。质粒pWVU-009携带630 bp的较短ORF。pQE系列质粒和pE53的复制子均含有933 bp的ORF。质粒pAM01和pE13的复制子含有972 bp的ORF。BLASTp分析显示推定RepA蛋白与一组沙雷氏菌复制蛋白（WP_286094311）具有最高一致性（超过95%）。保守结构域鉴定显示存在不完整的保守结构域RepA_IncFII_LM（NF040977），属于cl11495超家族。比较分析表明，47个RepA蛋白氨基酸序列的比对覆盖率为100%（pAM01和pE13）、97.5%（其他40个序列）和96.0%（pE53、pQE系列）。这些蛋白之间的相似性范围为83.5%至100%。三个截短的RepA蛋白（pPWN146.1、pPWN146.2和pWVU-009）因比对覆盖率不足而被排除。沙雷氏菌复制子与FII和FIC复制起始蛋白氨基酸序列的相似性范围分别为13.8%至16.2%和19.0%至21.5%。最大似然系统发育分析将所分析的沙雷氏菌复制子编码的推定RepA蛋白恢复为具有强支持的单系群，FII型RepA蛋白（NR1和pNDM_12TM）也被恢复为强支持的单系群。因此，每种复制子类型的RepA蛋白表现出多系起源。

4.5 CopB蛋白与Tap前导肽

在所有分析的复制子中，25个复制子含有开放阅读框，其推导氨基酸序列含有典型的CopB蛋白保守RepB-RCR_reg（pfam10723）结构域。质粒pPWN146.1含有两个复制子，但只有一个复制子含有copB基因。沙雷氏菌谱系质粒中CopB推导氨基酸序列的相似性范围为52.4%至100%。参考质粒pNDM_12TM与其他质粒的CopB推导氨基酸序列相似性在56.3%至75.9%之间。FII复制子与其他沙雷氏菌复制子之间CopB蛋白序列的相似性范围为52.9%至71.4%。FIC复制子与沙雷氏菌复制子之间CopB蛋白的相似性为53.5%至73.3%。在所有分析的复制子中均未鉴定出前导肽Tap，而在质粒pNDM_12TM中鉴定出编码该蛋白的78 bp ORF。

4.6 反义RNA CopA

对可能编码非编码RNA CopA的核苷酸序列进行多重比对，揭示了两个具有不同一致性的组。第一组由34个沙雷氏菌谱系CopA和pNDM_12TM质粒组成，序列一致性（顶部复制子）在75.8%至100%之间。第二组由16个CopA组成，彼此间一致性水平在82.6%至100%之间。第一组CopA保留了比NR1和P307质粒CopA组更多的保守基序。然而，第二组与第一组共享的保守基序很少，尽管此前显示第一组和第二组沙雷氏菌质粒中推定repA基因5′端邻近区域之间没有显著的一致性水平。

4.7 复制起始位点和复制终止位点

在所有分析的复制子中，除12个质粒外，均确定了可能的FII型复制起始序列。除质粒pPWN146.1的含copB复制子和pE17外，所有质粒均发现了FII型前导链复制终止位点（R_ter）。同时，在沙雷氏菌质粒复制子上未检测到后随链终止位点（L_ter）。

五、讨论与结论

研究结果强烈证实了所分析的沙雷氏菌谱系质粒区域中存在FII和FIC复制子典型的结构元件或其残余，但推定RepA蛋白的基因除外。系统发育结果表明，所分析质粒谱系的RepA蛋白起源于共同祖先。FII复制子RepA典型的不完整保守结构域的保留清楚地表明这些蛋白保留了复制功能，且共同祖先可能是FII型RepA蛋白。因此，这些被分析区域是参与质粒复制的复制子。相对较短的pSM22样质粒的存在及其广泛分布表明这种复制子类型是有功能的。值得注意的是，在50个复制子中均未发现移动遗传元件的插入，这可能表明这些区域存在插入的功能限制。pSM22质粒经过彻底注释，不含其他复制控制基因，这也表明可能的repA基因在复制控制中发挥作用。

无论copA和copB存在与否，最重要的发现是所有被分析复制子中均缺乏编码短Tap前导肽的序列。一方面，这表明这些质粒的复制机制已被完全修改，这与CopA和CopB的存在或缺失一致，它们显然不再参与复制调控，也与显著趋异的RepA的存在一致，RepA的合成不需要Tap。另一方面，Tap的缺失引发了关于所分析沙雷氏菌复制子可能复制调控机制的问题。研究人员推测推定repA基因mRNA的二级结构可能较弱或完全不存在，这使得mRNA无需Tap肽即可直接与核糖体结合。在R1质粒中，通过获得使repA mRNA二级结构不稳定的突变，实验证明了这种不依赖tap的翻译。此外，在相关质粒中，Rep蛋白可以作为组成型活性单体发挥作用，绕过伴侣介导的激活并支持复制起始而不需要正常的单体-二聚体平衡控制。研究人员还推测可能存在尚未被识别的参与复制的短ORF和/或各种反义RNA。

研究人员假设沙雷氏菌和FIC型复制子都从祖先FII型复制子演化而来。这些复制子中存在的FII型复制装置残余与此演化情景一致。其结构变化遵循编码复制起始蛋白（repA）基因的相似演化模式。同时，结果证实所分析的复制子恰好从沙雷氏菌属细菌质粒固有的祖先FII型演化而来。两组沙雷氏菌复制子——一组保留完整copB基因，另一组缺乏该基因——的共存表明copB在功能上变得可有可无后被二次丢失。比较基因组学结果（特别是pSMBC31-93K和pE05质粒复制子之间）支持关于copB基因还原性丢失的假设。编码copA基因的序列可能也已丢失。这些观察表明，沙雷氏菌谱系内质粒复制子的演化与演化一般模型的两个阶段一致：短阶段导致复杂性的爆发性和突然增加，随后的长还原阶段导致遗传物质的中性丢失或适应性基因组精简。在第一阶段，repA基因发生了突然而快速的演化（在沙雷氏菌复制子和FIC复制子中均如此），在下一阶段，前FII型复制子的非功能性装置（copB和copA）逐渐还原性丢失。

质粒的准确分类和鉴定在分子流行病学和微生物基因组学中发挥着关键作用，因为它们能够追踪抗菌素耐药性（AMR）和毒力在细菌群体中的传播和演化动态。IncF质粒（包括IncFII）是从人类和动物来源分离的最常报道的类型，携带编码碳青霉烯酶、超广谱β-内酰胺酶、喹诺酮耐药性等的基因。此外，IncFII质粒经常在比较基因组和功能研究中被研究。这些质粒的常见宿主Serratia marcescens是最广泛传播的机会性病原体之一，具有高遗传可塑性和适应各种生态位的能力。本研究分析的某些质粒携带抗生素耐药基因，并根据Plasmid MLST数据库被鉴定为FII或FIC型。本研究使得这些质粒以及其他被分析质粒和未来测序的质粒能够作为具有趋异候选FII相关复制子的成员在统一分类中被鉴定。

本研究的局限性在于未来需要进行功能研究来探索复制和不相容性机制，以提出新的复制子和不相容群。因此，所分析的复制子被提议为FII相关趋异候选谱系。

结论：本研究预测了沙雷氏菌质粒谱系中存在趋异的候选FII相关复制子，其在演化上与FIC和FII相关。这些结果扩展了细菌质粒复制装置多样性的知识前沿，将有助于探索其多样性、分布、流行病学和转移性。尽管如此，仍需进一步研究来确定这些复制子的复制和质粒不相容性细节，以可能提出新的复制子类型。