《Phycology》：Morphology, Molecular Data, and Fatty Acid Composition of Some Monoraphid Diatoms from the South China Sea, with Description of Two New Species of Astartiella
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研究人员运用光学显微镜、荧光显微镜、电子显微镜及分子生物学方法，对分离自越南附近南海海域的13株隶属于Schizostauron属、Astartiella属和Achnanthes属的海洋单壳缝硅藻进行了研究。基于研究结果，描述了Astartiella属的两个新
研究人员运用光学显微镜、荧光显微镜、电子显微镜及分子生物学方法，对分离自越南附近南海海域的13株隶属于Schizostauron属、Astartiella属和Achnanthes属的海洋单壳缝硅藻进行了研究。基于研究结果，描述了Astartiella属的两个新种：Astartiella triundulata和Astartiella zinaidae。研究人员提供了与近缘种的形态学比较，并讨论了分子分析结果。Schizostauron菌株被鉴定为S. trachyderma，并对其属内的隐存多样性（cryptic diversity）和遗传变异进行了考察。文中还提供了这些分类群的地理分布数据。研究人员获得了Schizostauron和Astartiella菌株的总脂肪酸谱（total fatty acid profile），并对结果进行了讨论。
论文解读文章
一、研究背景与意义
单壳缝硅藻（monoraphid diatoms）是羽纹硅藻中一个庞大而多样的类群，其显著特征在于仅在其中一个壳面（即具壳缝壳面，raphe valve, RV）上具有壳缝（raphe），而另一壳面（即无壳缝壳面，sternum valve, SV或rapheless valve, RLV）则具有纵向肋纹（sternum）或透明区域。传统观点认为单壳缝硅藻是从双壳缝硅藻（biraphid diatoms）演化分离而来，这一观点得到了形态发生学研究的支持。然而，随着分子生物学方法的发展和系统发育研究的深入，研究者发现单壳缝硅藻并非单系群（monophyletic group），而是由双壳缝硅藻中多次独立演化事件产生的多个分支组成，据估计代表3至5个独立演化支系，这一认识引发了该类群分类学的重大变革。
本研究聚焦于Schizostauron属和Astartiella属两个单壳缝硅藻属。Schizostauron属由Grunow建立，目前共有7个被接受的种名、11个同物异名和7个分类地位不确定的名称，除S. sorokinii外，所有物种均分布于热带和温带气候区的海洋沿岸底栖或附生栖息地。Astartiella属则基于Navicula minuscula var. bahusiensis建立，目前包含17个种和1个被接受的变种，其中仅有4个种具有分子数据。所有已知物种分布于全球海洋或半咸水环境。
多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs），包括omega-3二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, EPA）和α-亚麻酸（α-linolenic acid, ALA），是人类膳食补充剂以及水产养殖和农业的重要饲料成分。目前鱼油是最广泛使用的PUFA食物来源，但水产养殖业消耗了全球70%至80%的鱼粉和富含PUFA的鱼油作为配方饲料，因此研究者长期致力于开发PUFA的替代来源。
本研究首次报道了南海越南海域的Schizostauron和Astartiella属代表物种，获得了分子数据并详细研究了其形态学特征，同时进行了总脂肪酸分析，为理解该区域单壳缝硅藻的生物多样性、系统发育关系和生物化学特性提供了重要基础数据。
二、主要技术方法
研究人员于2024年7月在越南中部沿海进行了联合俄越考察，采集了浮游植物和附生植物样品。浮游植物样品通过29 μm浮游生物网过滤表层水获得，附生植物样品则通过振荡大型藻类表面获得，经系列筛网过滤后收集。水温和盐度使用Atago PAL-06S海水折射仪测量。单克隆菌株通过微吸管法在Zeiss Axio Vert A1倒置显微镜下建立，在ESAW液体培养基中于22至25°C、12小时光暗交替条件下培养。形态学研究采用光学显微镜（LM）、荧光显微镜（EFM）、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）。分子研究提取总DNA后扩增核18S rRNA基因V4区和质体rbcL基因，采用贝叶斯推断（Bayesian inference, BI）和最大似然法（maximum likelihood, ML）进行系统发育分析。脂肪酸分析采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术测定脂肪酸甲酯（FAME）组成。所有研究材料保藏于俄罗斯科学院季米里亚泽夫植物生理研究所的藻类培养与条形码保藏中心（CBMC）和标本馆（HD），复份玻片保藏于越南芽庄海洋学研究所海洋博物馆（VMO）。
三、研究结果
3.1 形态学分析
Astartiella triundulata新种（菌株CBMCsvn805、CBMCsvn811）：活细胞在壳面观呈线状椭圆形，具宽圆形末端和三波状边缘，带面观呈双凸形。叶绿体在壳面观呈H形，具有两个深的纵向凹陷和多个紧贴壳面和带面的宽裂片。细胞长15.2至17.1 μm，宽6.9至7.6 μm。清理后的壳面宽大，线状椭圆形，具三波状边缘和宽圆形末端，长14.0至18.7 μm，宽6.2至8.4 μm。壳缝直、丝状。具壳缝壳面中轴区窄线形，中央区极窄矩形，两侧延伸至壳面中心与边缘之间约一半处。无壳缝壳面中轴区同样窄线形，无中央区。SEM观察显示外部中央壳缝末端直而简单，远端末端弯向一侧并延伸至壳缘。中央区一侧存在单一瘘管（fistula），外部呈窄横向裂缝状开口，内部呈小椭圆形开口，内部开口两侧有两条增厚的硅质脊延伸至肋间。壳缝壳面条纹密度每10 μm 35至36条，无壳缝壳面条纹平行，密度每10 μm 29至30条，孔纹（areolae）顶端延长狭窄，每10 μm约130至135个。带环开放，开口处具楔形扩展。
Astartiella zinaidae新种（菌株CBMCsvn858、CBMCsvn882）：细胞在壳面观呈椭圆形披针形，具楔形圆形末端。叶绿体大，占据细胞大部分，具两个深而窄的顶端凹陷和紧贴壳面及带面的大圆形裂片。细胞长18.4至20.2 μm，宽6.8至8.5 μm。清理后的壳面椭圆形披针形，具楔形末端，长11.9至19.9 μm，宽5.2至8.4 μm。壳缝直、丝状。具壳缝壳面中轴区窄线形，中央区小、椭圆形。无壳缝壳面中轴区窄线形，无中央区。两壳面条纹在LM下清晰可辨，具壳缝壳面中央平行、末端放射状，每10 μm 30至31条；无壳缝壳面平行至弱放射状，每10 μm 29至32条。SEM观察显示外部中央壳缝末端直而简单，远端末端弯向一侧并延伸至壳缘。中央区一侧存在单一延长瘘管。无壳缝壳面内外均可观察到退化壳缝裂缝，孔纹顶端延长狭窄，每10 μm约140至145个。带环开放。
Schizostauron trachyderma：研究人员从南海越南归仁Bai Xep海滩的大型藻类中分离获得7株菌株（CBMCsvn1016、1017、1037至1041），其中CBMCsvn1016、1017分离自Jania属，CBMCsvn1037至1041分离自Turbinaria属。壳面宽椭圆形，近末端具明显肩部，末端延长且圆形。长20.6至31.1 μm，宽8.5至16.4 μm，长宽比1.80至2.12。两壳面中轴区窄线形，无壳缝壳面中轴区由明显纵肋（sternum）代表；具壳缝壳面中央区为狭窄不规则横纹（stauros），由缩短的条纹界定，横纹延伸至每个半壳面的约四分之三处。具壳缝壳面条纹放射状、弯曲，LM下呈细点状，每10 μm 22至26条；无壳缝壳面条纹平行至弱放射状，由矩形孔纹组成，每10 μm 11至14条。SEM观察显示具壳缝壳面大部分平坦，每个半壳面中部弱凹；无壳缝壳面沿顶端轴凹入，半壳面中部凸出。
Achnanthes kuwaitensis：研究人员从南海越南广义省Sa Huynh海滩浮游生物网样品中分离获得两株菌株（CBMCsvn909、CBMCsvn914）。壳面线形，中央略收缩，末端圆形。长43.2至53.5 μm，宽6.1至8.6 μm。具壳缝壳面中轴区极窄线形，中央区为窄矩形至不对称横带（fascia）。无壳缝壳面中轴区偏向壳缘，窄线形，无中央区。无壳缝壳面两端存在三角形末端圆斑（orbiculi）。两壳面条纹单列，具壳缝壳面弱放射状，每10 μm 10至12条；无壳缝壳面平行，每10 μm 10条。孔纹方形，具壳缝壳面每10 μm 12至15个，无壳缝壳面每10 μm 12至14个。SEM观察显示壳缝中央部分弱弯曲，外部中央壳缝末端膨大并略弯向一侧，远端末端钩状弯向一侧并延伸至壳缘。无壳缝壳面具内部增厚的肋纹，孔纹外部由筛板（cribra）覆盖。
3.2 分子数据与系统发育分析
研究人员基于18S rRNA和rbcL两个标记进行了系统发育分析。单壳缝硅藻的代表形成五个分支，分布于双壳缝硅藻之间。Stauroneidaceae科（Mastogloiales目）的代表形成支持率最高的分支（后验概率PP 1，似然自举值LB 100），包含两个亚支：第一亚支由单壳缝硅藻Schizostauron与Astartiella以及Karayevia与Madinithidium组成，两对之间为姐妹群关系且支持率高；第二亚支包含双壳缝硅藻Fistulifera、Craticula、Stauroneis、Prestauroneis和Parlibellus属的代表。Planothidium和Gogorevia属的代表形成另一高支持率分支。Cocconeis属代表形成最高支持率分支但位置支持弱。Achnanthaceae科（Bacillariales目）的单壳缝硅藻Achnanthes s. str.与双壳缝硅藻Craspedostauros形成最大支持率分支。
本研究的S. trachyderma菌株在系统发育树上与属内其他代表稳定聚于同一分支，但形成两个与GenBank中S. trachyderma菌株不同的独立组群：第一组包含菌株CBMCsvn1037至1041，第二组包含CBMCsvn1016、1017。成对序列比较显示，GenBank中S. trachyderma菌株与第一/第二组在rbcL基因上的相似性分别为99.1%/98.7%；在V4 18S rRNA区域，GenBank菌株与第二组菌株100%相似，与第一组菌株仅差1个核苷酸（相似性99.8%）。Schizostauron属种间最小序列相似性在rbcL基因为97.4%，在V4 18S rRNA为97.8%。
四株Astartiella菌株属于两个新种，在系统发育树上与其他种明显分离。种内菌株序列在两个基因上均100%相似。Astartiella种间在V4 18S rRNA区域序列相似性较高（99.0%至99.5%），而在rbcL基因上种间区分明显，序列相似性在95.1%至98.1%之间。
A. kuwaitensis菌株在系统发育树上与Achnanthes s. str.其他种形成独立分支。由于GenBank中仅有一株A. kuwaitensis菌株NIES1349的18S rRNA序列可用，研究人员基于p距离比较了18S rRNA区域序列，发现本研究的菌株与NIES1349菌株的序列相似性仅为95.2%，差异达到种间水平。
3.3 总脂肪酸组成分析
Schizostauron菌株在生长稳定期生物量分析显示饱和脂肪酸（SFA）16:0棕榈酸占优势（占总脂肪酸的35.08%和37.47%），单不饱和脂肪酸（MUFA）16:1（n-7）棕榈油酸（16.52%和15.0%）和极长链多不饱和omega-3 20:5（n-3）二十碳五烯酸（16.19%和12.56%）含量丰富。两种菌株的脂肪酸谱均含有长链omega-3 18:3（n-3）α-亚麻酸（5.44%和4.80%）、单不饱和18:1（n-9）油酸（7.48%和7.53%）和饱和18:0硬脂酸（8.20%和9.99%）。还检测到少量极长链多不饱和omega-6 20:4（n-6）花生四烯酸（4.99%和3.93%）和16:2顺式-7,10十六碳二烯酸（3.23%和3.64%）。
Astartiella菌株脂肪酸分析显示饱和16:0棕榈酸占优势（占总脂肪酸的34.02%和34.51%），单不饱和18:1（n-9）油酸（12.83%和9.24%），长链多不饱和omega-3 18:3（n-3）α-亚麻酸（25.28%和25.85%）和20:5（n-3）二十碳五烯酸（10.09%和11.54%）含量丰富。两种菌株均含有少量饱和18:0硬脂酸（8.15%和9.85%）、14:0肉豆蔻酸（4.08%和3.85%）和极长链多不饱和omega-6 20:4（n-6）花生四烯酸（5.55%和5.16%）。
四、讨论与结论
Astartiella新种的形态比较：A. triundulata新种具有Astartiella属的所有特征性结构，但其壳缘三波状轮廓在该属代表中独一无二。A. zinaidae新种可与多种已知Astartiella种比较：A. bahusiensis和A. bahusiensoides具有相似的椭圆形披针形轮廓，但新种壳面更为细长，且中央区更明显、条纹密度不同；A. punctifera体型更大且条纹更放射状、密度更低；A. almalikii壳面更小且轮廓更线形，无中央区，条纹和孔纹密度更高；A. glacialis壳面末端明显亚喙状。
S. trachyderma的隐存多样性：本研究的S. trachyderma菌株在形态上最接近来自日本长崎的原始材料，但与来自红海（沙特阿拉伯）的GenBank菌株在壳面比例、轮廓和末端延长程度上存在差异，然而这些差异不足以确证不同物种。成对序列比较显示V4 18S rRNA区域序列相似性极高（99.8%至100%），而rbcL基因的序列差异为0.9%至1.3%，表明该种存在隐存多样性。值得注意的是，不同遗传标记在物种区分效率上存在差异：本研究的S. trachyderma菌株与形态相似的S. kajotkei在rbcL基因上相似性高达99.2%至99.4%，但在V4 18S rRNA区域相似性仅为98.3%至98.5%；相反，S. trachyderma与S. rawaii在V4 18S rRNA区域相似性高（99.5%至99.8%），而rbcL基因相似性不超过98.1%。Schizostauron属种间遗传距离与S. trachyderma不同系统类型（phylotype）间的差异范围相似，因此难以确定种内和种间序列差异的界限。不同硅藻属的种间距离差异显著，例如Schizostauron或Psammodictyon属种间关系密切，而Achnanthes s. str.或Mastogloia属的rbcL基因种间距离可达13.9%。这一发现对宏条形码（metabarcoding）数据分析中物种水平操作分类单元（OTU）阈值设定具有重要意义，过高的聚类阈值可能导致物种多样性被低估。
A. kuwaitensis的分子数据：本研究的A. kuwaitensis菌株与GenBank中菌株NIES1349在V4 18S rRNA区域序列差异达4.8%，达到种间水平。NIES1349菌株分离自日本相模湾森户海滩的聚乙烯袋上，公开图像仅显示带面观的活体壳面，无法进行形态学比较。差异可能源于物种的隐存多样性或菌株间的形态差异，需要进一步扩展具有完善文档记录的参考序列数据库。
地理分布：Schizostauron属物种在自然基质中丰度较低，但S. citronella和S. trachyderma等较老物种在全球沿岸海域有广泛记录。新近描述的物种目前仅知分布于模式产地。由于LM下形态差异细微且生活史中壳面大小存在变异，自然样品中精确的物种鉴定存在困难。A. kuwaitensis是热带海洋物种，在全球暖水海洋沿岸广泛分布。Astartiella属中分布最广的可能是A. bahusiensis，其他物种仅发现于模式产地。本研究从越南沿海采集的102个附生、石生和沿岸沙样品中，仅在6个样品中发现了Astartiella、Schizostauron和A. kuwaitensis的代表，这些分类群在南海越南海域的硅藻区系研究中未见报道，可能归因于鉴定错误。
脂肪酸分析：Astartiella和Schizostauron菌株的脂肪酸组成在同属菌株间几乎没有差异，但两属之间存在异同。两属代表均以高浓度16:0棕榈酸为特征，并含有显著浓度的18:1（n-9）油酸和20:5（n-3）二十碳五烯酸，同时积累稀有的20:4（n-6）花生四烯酸。值得注意的是，Astartiella属菌株积累高浓度18:3（n-3）α-亚麻酸（高达25.85%），而Schizostauron属仅积累至5.44%。Astartiella的脂肪酸谱还缺乏7,10十六碳二烯酸和16:1（n-7）棕榈油酸。总体而言，Astartiella以更高浓度的PUFA为特征，而Schizostauron以更高浓度的MUFA为特征。与近缘属Fistulifera、Craticula和Stauroneis的代表相比，后者的脂肪酸谱与Schizostauron菌株相似，均以16:0棕榈酸、16:1（n-7）棕榈油酸和20:5（n-3）二十碳五烯酸为主要成分。然而Astartiella缺乏棕榈油酸却具有高浓度α-亚麻酸，这一差异确认了继续该领域研究的重要性和相关性。所有研究菌株均表现出高含量的必需多不饱和omega-3脂肪酸，具有潜在的应用价值。
综上所述，本研究首次在南海越南海域发现并详细描述了Schizostauron和Astartiella属的代表物种，包括两个新种A. triundulata和A. zinaidae，首次记录了A. kuwaitensis在越南沿岸水域的分布，揭示了S. trachyderma的隐存多样性，并提供了这些分类群的脂肪酸组成数据，为理解单壳缝硅藻的多样性、系统发育关系和生物技术应用潜力提供了重要基础。
