《Brain Sciences》：A Murine Model of Pseudomonas aeruginosa Pneumonia-Induced Sepsis-Associated Encephalopathy Reveals Upregulation of the NLRP3/Caspase-1/IL-1β Pathway
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目的：本研究首次通过鼻内给予铜绿假单胞菌（PA）建立肺炎源性脓毒症相关性脑病（SAE）小鼠模型，旨在提供一种更贴近临床肺炎源性脓毒症病程的补充模型，并探讨NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路在该模型中的作用。方法：研究人员经鼻内给予小鼠PAO1以诱导
目的：本研究首次通过鼻内给予铜绿假单胞菌（PA）建立肺炎源性脓毒症相关性脑病（SAE）小鼠模型，旨在提供一种更贴近临床肺炎源性脓毒症病程的补充模型，并探讨NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路在该模型中的作用。方法：研究人员经鼻内给予小鼠PAO1以诱导肺部感染源性SAE，以腹腔注射脂多糖（LPS）作为阳性对照，假手术组作为对照。在干预后24小时通过临床评估和组织病理学验证SAE。采用RT-qPCR检测海马组织中NLRP3、ASC和Caspase-1的表达；采用ELISA检测血清中IL-1β、IL-18、TNF-α、S100B、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和NT-proCNP的水平。结果：鼻内滴注1.2×107 CFU的PAO1成功在小鼠中复制了SAE。SAE组和LPS组海马组织中NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA水平以及上述血清炎症标志物和脑损伤标志物的浓度均显著高于假手术组（所有p<0.05）。各组间这些血清指标在8小时、16小时和24小时时间点未观察到显著的时序性差异（所有p>0.05）。结论：研究人员成功建立了PA肺炎诱导的小鼠SAE模型。利用该模型，研究人员证实NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的上调与SAE的发病机制和进展相关。
研究背景与意义
脓毒症相关性脑病（SAE）是继发于全身性脓毒症的常见急性脑功能障碍，表现为注意力、认知能力改变，严重时可出现谵妄、昏迷等，与重症监护室住院时间延长、长期认知功能损害及死亡率升高密切相关。SAE在ICU成人脓毒症患者中的发病率高达50%至70%。然而，目前SAE缺乏明确的诊断标准和靶向治疗手段。动物模型是研究疾病过程和阐明炎症机制的重要工具。现有SAE模型多采用盲肠结扎穿孔术（CLP）或腹腔注射脂多糖（LPS），前者主要模拟肠杆菌科细菌引起的多微生物感染，后者虽简便但无法完全反映真实脓毒症的复杂性和长期病理生理特征。临床上，由铜绿假单胞菌（PA）肺炎引发的SAE研究有限，尚未得到充分探索。近年来，肺炎诱导的脓毒症模型因更贴近临床实际而日益受到重视。因此，本研究旨在通过鼻内接种PA建立肺源性SAE小鼠模型，并与传统LPS模型进行比较，同时探讨NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路在该模型中的作用，为SAE的早期诊断、病情评估和预后判断提供依据。
研究方法概述
研究人员从北京维通利华实验动物技术有限公司购入50只6至8周龄、体重18至20克的SPF级健康雌性BALB/c小鼠。采用标准PAO1菌株（来自南开大学生命科学学院分子微生物学与技术教育部重点实验室药物化学国家重点实验室），经鼻内给药建立肺炎模型，并以腹腔注射LPS（10 mg/kg）作为阳性对照。通过小鼠脓毒症评分（MSS）、神经行为学评估（角膜反射、耳廓反射、翻正反射、伤害性针刺反射、甩尾反射）以及旷场实验评价疾病严重程度和行为学变化。采用苏木精-伊红（HE）染色观察肺和海马组织病理学改变。运用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测海马组织中NLRP3、ASC和Caspase-1的mRNA表达水平。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定不同时间点（8、16、24小时）血清中炎症因子（IL-1β、IL-18、TNF-α）和神经损伤标志物（S100B、NSE、NT-proCNP）的浓度。
研究结果
3.1 PAO1-1.2组和LPS组表现出更高的死亡率、更严重的临床评分和旷场实验中运动活性降低
24小时存活率显示，PAO1-1.6组死亡率达90%，超出可接受范围。PAO1-1.2组和LPS组死亡率均为30%，而PAO1-0.8组和对照组分别为10%和0%。与对照组和PAO1-0.8组相比，PAO1-1.2组和LPS组的脓毒症严重程度评分显著升高，神经行为学评分显著降低（所有p<0.001），两组间无显著差异。基于此，PAO1-1.2组被指定为SAE组，PAO1-0.8组为非SAE（NSAE）组。
3.2 旷场实验
旷场实验结果显示，与对照组和NSAE组相比，SAE组和LPS组小鼠的运动轨迹明显减少，总移动距离、平均速度和中央区域停留时间均显著降低（p<0.001），表明SAE模型诱导后24小时小鼠探索行为显著下降。
3.3 多器官功能障碍
与对照组相比，SAE组和LPS组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿素氮和肌酐水平均显著升高（所有p<0.05），提示存在系统性器官功能障碍。SAE组与LPS组间各参数无显著差异，NSAE组与对照组也无显著差异。
3.4 病理学发现
HE染色显示，对照组肺组织结构完整、无炎细胞浸润；SAE组和LPS组均出现明显的炎细胞浸润和肺泡结构扭曲，两组严重程度相似。海马组织HE染色显示，对照组海马结构清晰、细胞排列有序；SAE组和LPS组则出现神经元排列紊乱、细胞水肿和神经元密度降低，两组严重程度相当。
3.5 SAE组和LPS组海马组织中NLRP3、ASC和Caspase-1上调
与对照组相比，SAE组和LPS组海马组织中NLRP3、ASC和Caspase-1的mRNA表达水平均显著升高（所有p<0.05）。
3.6 血清炎症标志物和神经损伤标志物水平
在8、16和24小时三个时间点，SAE组和LPS组血清中TNF-α、IL-1β、IL-18、NT-proCNP、NSE和S100B的浓度均显著高于对照组（所有p<0.01）。但在各组内部，这三个时间点之间未观察到显著的统计学差异（所有p>0.05）。
讨论与结论
讨论部分指出，SAE是重症肺炎患者的常见并发症，其诊断因缺乏特异性临床表现和生物标志物而面临挑战。本研究成功建立了PA肺炎诱导的新型小鼠SAE模型，并证明NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的上调与SAE发病机制相关。该模型通过综合神经行为学评分、旷场实验和海马特异性结构损伤来区分真正的SAE与严重全身性疾病导致的继发性神经功能缺损，比传统腹腔注射LPS模型更贴近临床肺炎源性脓毒症的病程。研究结果表明，肺部感染触发的全身性炎症反应与脑部NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路的转录上调相关，伴随细胞因子释放和神经元损伤。然而，转录水平的发现需谨慎解读，因为NLRP3炎症小体的完全激活需要启动和激活两个步骤，本研究的RT-qPCR数据仅证明了转录启动，尚需进一步通过蛋白水平（如活化的Caspase-1 p20、IL-1β p17和GSDMD）和炎症小体组装（ASC斑点）的证据来确认功能性激活。LPS模型与PAO1模型虽然产生了相似的病理生理终点，但PAO1肺炎诱导的SAE模型的关键优势在于其病因学相关性——它重现了原发性重症肺炎进展为肺外脓毒症和脑病的更常见临床情景，尤其适用于免疫功能低下患者和ICU环境中PA作为主要病原体的情况。关于生物标志物，研究结果与既往报道一致，即血清S100B、NSE和NT-proCNP水平升高与SAE及不良预后相关，但这些标志物并非SAE特有，应视为系统性神经血管损伤的非特异性辅助指标而非确诊依据。此外，各标志物在8、16、24小时未见显著时序性差异，提示它们可能有助于SAE筛查，但难以可靠反映疾病进展。未来研究应探索神经丝蛋白、sTREM2和miR-370-3p等新型生物标志物，并纳入脑脊液分析以直接确认中枢神经炎症。
研究结论翻译：总之，研究人员通过鼻内给药成功建立了一种新的PA肺炎诱导的SAE小鼠模型。利用该模型，研究人员证明PA肺炎与海马组织中NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路成分的显著上调相关，同时伴有血清炎症介质（IL-1β、IL-18、TNF-α）和神经损伤标志物（S100B、NSE、NT-proCNP）水平的升高。这些发现表明，该通路的上调可能参与了肺炎源性SAE的发病机制。本研究为未来探索该疾病的早期诊断生物标志物和潜在治疗靶点奠定了基础。有必要开展进一步研究，采用药理学抑制剂和确切的炎症小体激活实验来确定因果关系，并将这些发现转化为临床应用。
