《Journal of Bacteriology》：Genetic basis of glycine and L-serine toxicity in Staphylococcus aureus and the case for glycine as an antibiotic adjuvant
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高浓度氨基酸甘氨酸与L-丝氨酸对细菌的毒性早在数十年前即被发现。本研究采用转座子插入测序（Tn-seq）实验，确定人类致病菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在过量L-丝氨酸、二甘氨酸或甘氨酸条件下维持生长所必需的基因。结果表明，特定
高浓度氨基酸甘氨酸与L-丝氨酸对细菌的毒性早在数十年前即被发现。本研究采用转座子插入测序（Tn-seq）实验，确定人类致病菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在过量L-丝氨酸、二甘氨酸或甘氨酸条件下维持生长所必需的基因。结果表明，特定平衡性氨基酸的胞内积累——如过量甘氨酸存在时的丙氨酸——是抵抗氨基酸毒性的主要机制。与该模型一致，各处理条件下均有特定氨基酸与肽转运体为适应度所必需：肽转运体DtpT在过量L-丝氨酸或甘氨酸条件下对适应度至关重要，丙氨酸转运体AapA在二甘氨酸条件下为必需。Tn-seq结果还鉴定出胱氨酸/半胱氨酸摄取转运体TcyABC在过量L-丝氨酸条件下为必需，提示肽摄取与半胱氨酸摄取均有助于L-丝氨酸耐受。除摄取机制外，甘氨酸与二甘氨酸毒性可被D-丙氨酸氨基转移酶（Dat）中和，该酶为D-丙氨酸合成所必需。Dat与DtpT功能在过量甘氨酸条件下为必需、而AapA并非必需，其原因是过量甘氨酸抑制丙氨酸摄取。基于此发现，研究人员发现甘氨酸与丙氨酸类似物抗生素D-环丝氨酸联合处理对金黄色葡萄球菌生长具有强协同抑制作用。总体而言，本研究鉴定了金黄色葡萄球菌过量氨基酸耐受的可靶向机制，对利用易获得且生物相容的氨基酸甘氨酸与L-丝氨酸开发新型联合治疗具有意义。
研究背景：高浓度甘氨酸与L-丝氨酸对细菌的抑制作用已被认识数十年，补充这类氨基酸可在体外抑制细菌生长、在体内降低宿主发病率与炎症，并增强细菌对宿主补体杀伤的敏感性。然而，若要将这些氨基酸用于抗感染治疗，需降低其有效抑菌浓度，因此必须阐明金黄色葡萄球菌抵抗甘氨酸与L-丝氨酸毒性的遗传机制。既往研究提示，过量甘氨酸主要通过拮抗利用丙氨酸的酶、以及在肽聚糖交联中以甘氨酸错误替代丙氨酸而抑制细胞壁合成；而L-丝氨酸毒性在枯草芽孢杆菌中主要与苏氨酸代谢受抑相关，但金黄色葡萄球菌如何应对这两种氨基酸胁迫尚不清楚，且降解代谢在其解毒中的作用未被研究。基于此，研究人员以USA300谱系改造菌株TM283构建的转座子插入文库开展转座子插入测序（Tn-seq）筛选，并结合基因缺失突变体单培养验证、生长曲线、最小抑菌浓度（MIC）测定、棋盘微量稀释法（checkerboard assay）、靶向质谱代谢组学等手段，系统解析耐受机制。
主要关键技术方法（不超过250字）：研究人员采用转座子插入测序（Tn-seq），在菌株TM283转座子文库中比较125 mM L-丝氨酸、125 mM glycine、500 mM diglycine处理与对照的基因插入计数变化，以条件必需与有害基因界定适应度；采用基于pIMAY-Z质粒的同源重组构建洁净缺失突变体，并结合Nebraska转座子突变体文库提供的突变株；通过96孔板生长曲线与MIC测定、D-环丝氨酸棋盘联合药敏试验评价协同作用；采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）靶向代谢组学测定培养上清氨基酸消耗。菌株来源为USA300-TCH1516衍生株TM283及近等基因株JE2。
研究结果：
Tn-seq鉴定介导氨基酸毒性抗性与敏感性的基因：在三种处理中条件必需基因重叠有限，无基因在三者中均必需，而有6个基因在所有处理中有害；提示耐受机制具有条件特异性。
三羧酸循环（TCA cycle）与氧化呼吸增强甘氨酸与L-丝氨酸毒性：KEGG分析显示，各处理中有害基因富集于TCA循环与氧化磷酸化，琥珀酸脱氢酶（sdhABC）与延胡索酸水合酶（fumC）在各处理中均有害，提示活跃呼吸增加对过量氨基酸的敏感性。
过量L-丝氨酸条件下必需基因：二肽转运体dtpT缺失适应度下降最强，洁净缺失突变体证实其敏感性增强；二肽酶pepV亦必需，而dat缺失无影响，说明PepV介导的肽水解独立于dat表达发挥作用；ptsH与ccpA提示葡萄糖饥饿加剧毒性；胱氨酸/半胱氨酸转运体tcyABC必需，而丝氨酸脱氢酶影响有限。
过量甘氨酸条件下必需基因：pepV与dat插入适应度缺陷最强，但单培养中dat缺失在80 mM以上甘氨酸不能生长而pepV缺失与野生型无异，提示pepV表型源于对dat的极性效应；dat缺失可由L-丙氨酸或D-丙氨酸补充 rescue；dtpT缺失敏感性增强；肽聚糖编辑因子pgeF缺失使MIC降至250 mM，dat与pgeF双缺失在20 mM甘氨酸即严重生长缺陷；auxA、mprF等细胞包膜基因亦重要；甘氨酸裂解系统（GCV）与glyA并非关键。
过量二甘氨酸条件下必需基因：ccpA与ptsH影响最大，aapA为必需；dat在Tn-seq中无影响，但单培养中dat缺失在进入稳定期后光密度下降，提示丙氨酸合成在后期起作用。
过量甘氨酸抑制丙氨酸摄取：alr转座子突变体在含肽培养基中不敏感，但在仅含游离氨基酸的化学限定培养基（CDM）中过量甘氨酸下生长缺陷；LC-MS显示100 mM甘氨酸处理使丙氨酸消耗减少3.2倍，而苏氨酸消耗不受影响，提示甘氨酸抑制游离丙氨酸摄取。
甘氨酸与D-环丝氨酸协同抑制金黄色葡萄球菌生长：棋盘试验中联合处理的分级抑菌浓度指数（FICI）为0.09，15.6 mM甘氨酸联合1.25 μg/mL DCS即可抑制生长，且为抑菌而非杀菌；在aapA突变体中仍呈协同（FICI=0.26）。
讨论与结论：本研究表明，直接分解代谢并非应对过量氨基酸的核心，耐受主要依赖维持平衡性氨基酸的摄取与合成；肽摄取在甘氨酸与L-丝氨酸处理中关键，而二甘氨酸处理中仅游离丙氨酸转运体AapA重要。过量甘氨酸抑制丙氨酸摄取，解释了Dat合成丙氨酸的必要性以及Dat与DCS的协同基础，DCS与甘氨酸共同靶向D-ala-D-ala连接酶（Ddl）。TCA循环与呼吸失活带来的适应度优势可能与氧化应激降低有关；ptsH与ccpA缺失可能通过诱导摄取系统加重L-丝氨酸与二甘氨酸毒性。该研究提示甘氨酸可作为DCS的抗生素佐剂以降低其有效剂量，并为甘氨酸联合抑制丙氨酸合成药物、L-丝氨酸联合阻断半胱氨酸摄取的组合策略提供依据。
