三维培养抑制胰腺成纤维细胞活化并限制胰腺癌细胞与成纤维细胞间的旁分泌信号传导

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Three-dimensional culture suppresses pancreatic fibroblast activation and limits paracrine signaling between pancreatic cancer cells and fibroblasts

　　

摘要 背景：胰腺成纤维细胞在胰腺导管腺癌（PDAC）的发生、进展及治疗受限中发挥重要作用，是重要的研究领域。传统的二维（2D）体外模型无法完全模拟这些基质细胞在PDAC中的复杂性，如细胞间相互作用、形态学特征及对体内环境刺激的反应，因此三维（3D）培养系统成为进一步研究的理想平台。 方法：研究人员通过分析不同培养方式对转录组学的影响，比较了胰腺成纤维细胞在2D和3D培养系统中的行为差异。原代小鼠胰腺成纤维细胞分别进行单层培养和3D球体培养。采用成纤维细胞与KC小鼠胰腺癌细胞（KCs）之间的间接共培养系统以研究癌细胞的旁分泌效应。利用RNA测序（RNA-seq）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）进行数据分析，并以油红O染色作为辅助验证。 结果：在3D磁悬浮模型中观察到成纤维细胞的失活，表现为活化标志物Acta2、Fap和Ctgf的下调，以及脂滴稳定因子Plin2的上调。与2D相比，3D模型中缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路显著富集。油红O染色证实3D培养模型中细胞质脂滴较2D培养模型明显增多。3D培养中单培养和共培养均观察到活化标志物下调和脂质积累，表明这是细胞特异性行为而非肿瘤细胞的影响。 结论：3D磁悬浮培养可作为研究成纤维细胞失活状态的模型，而与KC肿瘤细胞共培养则有助于癌症-成纤维细胞旁分泌相互作用的研究。

三维培养重塑胰腺成纤维细胞状态：从活化到失活的转录组学证据

一、研究背景与意义

胰腺导管腺癌（PDAC）尽管发病率相对较低，却是极具侵袭性的恶性肿瘤。根据2024年全球癌症统计，PDAC在常见癌症中排名第十一位，但死亡率却高居第六位，约占男性和女性癌症死亡总数的二十分之一。2025年美国癌症统计报告将其列为癌症相关死亡的第三大原因，五年生存率低至8%。在欧盟地区，胰腺癌预计将超越乳腺癌成为癌症死亡的第三大原因。这些严峻的统计数据凸显了改善疾病进程和患者预后的迫切需求。

PDAC的生物学特征之一是显著的基质发育，这与胰腺成纤维细胞密切相关。尽管成纤维细胞仅占胰腺细胞的不到5%，但它们在组织稳态维持中发挥重要作用，包括维持基底膜和组织结构、通过分泌基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制剂调控细胞外基质（ECM）周转。组织损伤时，胰腺成纤维细胞被激活，增加ECM产生以促进组织修复。在体外，成纤维细胞可以在静止和活化状态之间切换。成纤维细胞在癌变早期即被募集，可通过直接细胞接触和旁分泌通讯影响肿瘤的侵袭和转移。在胰腺癌背景下，胰腺成纤维细胞也被称为癌症相关成纤维细胞（CAFs），它们促进了PDAC中丰富的结缔组织增生反应。静止状态的成纤维细胞在核周脂滴中储存脂质和维生素A，表达波形蛋白（Vimentin）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）等标志物；活化后，这些脂滴消失，细胞延伸胞质突起，呈现以α平滑肌肌动蛋白（ACTA2）表达为特征的肌成纤维细胞表型。

传统的2D培养是临床前研究中最常用的模型，具有培养时间短、性能高、可重复性好和成本效益高等优点，但也存在诸多局限性，包括与3D培养相比细胞形态和代谢的巨大差异。2D细胞无法模拟肿瘤结构，干扰细胞和环境相互作用，影响对肿瘤和基质发育及相互作用机制的研究。2D系统还被认为会改变基因表达、mRNA剪接和细胞代谢。3D培养系统旨在克服传统2D模型的部分缺陷，在转录组学、代谢和细胞信号传导方面更接近体内生长状态。球体和类器官是癌症研究中最广泛使用的两种3D培养方法。球体通常通过自发或诱导细胞聚集从已建立的细胞系或原代细胞产生，更接近地再现肿瘤微环境的关键特征，包括增强的细胞间相互作用、改变细胞间信号传导以及氧和营养梯度的形成。本研究采用磁悬浮3D培养系统，该技术由Souza等人于2010年首次提出，结合了无载体系统的优点且无搅拌剪切应力，支持比悬滴法更大的球体和更多的细胞数量。

二、研究设计与技术方法

研究人员从7-10周龄野生型C57BL/6J小鼠胰腺中分离原代胰腺成纤维细胞，采用Nycodenz梯度离心法。胰腺癌细胞系来源于KC（Ptf1a/p48-Cre; lox-stop-lox-Kras^G12D/+）小鼠，由海德堡大学提供。共培养采用两种方式：传统2D Transwell系统和3D磁悬浮模型。3D培养使用Shuttle?-PL纳米颗粒与成纤维细胞孵育至少8小时，通过磁盖使细胞在气液界面悬浮聚集形成球体。研究采用RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析，使用DESeq2进行差异基因表达分析，ClusterProfiler进行GO和KEGG通路富集分析，并通过定量RT-PCR（qPCR）验证关键基因表达，油红O染色检测脂滴积累。

三、主要研究结果

5.1 免疫细胞化学：对分离的胰腺成纤维细胞进行活化标志物ACTA2和FAP及上皮标志物CK-19的免疫细胞化学染色，结果显示细胞在早期和晚期传代中均强阳性表达ACTA2和FAP，而CK-19呈阴性，证实了分离细胞的纯度和成纤维细胞身份。

5.2 RNA测序数据质量：所有样本碱基错误率低于0.03%，超过89.80%的读数在过滤后被认定为清洁读数，总比对读数超过90%，生物学重复间的Pearson相关系数介于0.905至0.990之间，表明数据质量高、重复性好。

5.3 3D培养中胰腺成纤维细胞随时间的发育及与2D模型的比较：2D培养在两个时间点间无显著差异表达基因（DEGs），而3D培养有1224个显著DEGs。KEGG通路富集分析显示18条显著富集通路，其中ECM-受体相互作用和黏着斑通路在24小时3D培养中上调，Rap1信号通路在72小时上调。ECM-受体相互作用和黏着斑通路中有14个重叠基因上调，包括Vtn、Col6a3、Itga11、Col1a1等，表明ECM产生和细胞黏附增强。纳米颗粒暴露未引起显著差异基因表达，证实纳米颗粒不影响细胞培养条件。

5.4 2D和3D单培养的差异：2D与3D单培养比较显示，24小时有1549个上调和1615个下调基因，72小时有2295个上调和2202个下调基因。3D单培养在两个时间点均显示HIF-1信号通路和铁死亡通路的持续上调。活化标志物Acta2、Fap和Ctgf在3D培养中显著下调，且随时间推移呈进一步降低趋势，表明3D培养时间延长促进成纤维细胞失活。脂滴相关基因Plin2在3D单培养中较2D模型在两个时间点均明显上调。

5.5 KC共培养与单培养模型的全局分析：主成分分析（PCA）显示，24小时时共培养和单培养样本无明显聚类，72小时时2D共培养样本按处理状态聚类。3D培养样本较2D培养表现出更大的异质性。

5.6 KC肿瘤细胞对3D胰腺成纤维细胞的影响：2D共培养与单培养比较在24小时有19个DEGs，72小时有52个DEGs，72小时显著上调Notch信号通路。3D共培养与单培养比较在24小时有10个DEGs（包括Arxes2、Snap25、Cpm、Mmp10、Mmp13等），72小时仅1个上调基因Cxcl1。3D共培养24小时富集突触囊泡循环、胰岛素分泌、IL-17信号通路等，72小时富集IL-17信号通路、TNF信号通路、趋化因子信号通路等。3D共培养24与72小时比较显示563个DEGs，24小时样本显示ECM-受体相互作用和黏着斑通路上调。iCAF标志基因分析显示，3D共培养72小时富集Ccl2、Il6、Il11、Lif、Cxcl1、Cxcl2等基因，24小时高表达Ndufa4l2和Pnpla3。

5.7 定量RT-PCR验证：qPCR验证了72小时时间点的结果，Acta2、Fap和Ctgf在2D单培养和共培养中均较3D样本显著上调，而Plin2下调。3D共培养与3D单培养比较显示Acta2和Ctgf有非显著的上调趋势。

5.8 油红O染色：油红O染色证实3D球体中脂滴大量积累，而2D培养中仅见轻度脂滴积累。SGBS前脂肪细胞系作为阳性对照显示大脂滴。脂滴积累是胰腺星状细胞（PSCs）的特征性表现。

四、讨论与结论

研究表明，3D磁悬浮培养中成纤维细胞失活表现为活化标志物下调、脂滴积累和Plin2上调，且该效应在单培养和共培养中均存在，提示这是细胞内在效应而非肿瘤细胞影响。3D培养中HIF-1信号通路富集表明球体内部存在缺氧梯度，类似于肿瘤球体的坏死核心-静止区-增殖层结构。3D培养本身诱导的显著转录组变化可能掩盖了肿瘤细胞的短期旁分泌效应，但Mmp10、Mmp13和Cxcl1的上调仍提示肿瘤-基质串扰的存在。该模型为研究成纤维细胞活化与失活状态转换提供了有价值的平台，也为癌症-成纤维细胞旁分泌相互作用研究提供了工具。进一步研究需阐明磁悬浮在成纤维细胞失活中的具体作用机制，并比较不同3D培养系统中该效应的普遍性。