脂质组成调控脂质纳米颗粒两次给药后的器官特异性反应原性

《Pathophysiology》：Lipid Composition Modulates Organ-Specific Reactogenicity of Lipid Nanoparticles After Two Administrations

　　

背景： 脂质纳米颗粒（LNPs）可激活先天免疫，但决定重复给药后反应原性的因素尚不明确。研究人员比较了肌内注射含mRNA疫苗所用离子化脂质的空LNPs后的全身性、局部及器官特异性反应。方法： 雌性BALB/c小鼠接受两次肌内注射，间隔2周，分别给予LNP-4（四组分，ALC-0315为唯一离子化脂质；59 nm）或LNP-5（五组分，等摩尔ALC-0315/SM-102，总离子化脂质含量相同；86 nm）。在第二次注射后24小时监测体重15天，并通过组织学、免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）、Western blotting及定量PCR（qPCR）评估血液生化参数、注射部位组织学以及下丘脑、肝脏、肺和脾脏的形态学与分子标志物。结果： 两种LNPs均伴随短暂体重下降、中度生化改变及局部反应原性。最显著的器官特异性反应出现在肝脏和下丘脑。两种LNPs均诱导肝血窦扩张和白细胞浸润，但LNP-4与更多髓系细胞数量及更高炎症标志物表达相关。在下丘脑中，LNP-4较LNP-5产生更广泛的炎症和髓系标志物表达变化。所检器官未见明显结构损伤。结论： 重复LNP给药后出现全身性和局部反应原性，且不同制剂间的器官特异性变化存在差异，可能反映脂质组成、粒径及脂质剂量的影响。在LNP-based疫苗递送系统的设计和安全性评价中应考虑载体组成。

论文解读

一、研究背景与目的

脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles，LNPs）作为mRNA递送载体的成功应用，主要归功于离子化脂质的发展。两款针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗BNT162b2（Pfizer-BioNTech）和mRNA-1273（Moderna）分别采用ALC-0315和SM-102作为离子化脂质。与永久带电的阳离子脂质相比，离子化脂质在生理pH下保持中性、在内涵体酸性环境中质子化，从而提供更高效的mRNA包封和递送，同时降低非特异性毒性。然而，mRNA-LNPs给药可能伴随局部和全身性反应，包括疼痛、肿胀和发热。尽管采用N1-甲基假尿苷修饰的mRNA可降低TLR-7/TLR-8介导的先天免疫受体激活，mRNA治疗药物的反应原性仍然显著。研究表明，炎症反应不仅由mRNA组分驱动，LNPs本身也具有内在佐剂活性，可激活靶器官的免疫反应。离子化脂质可通过MyD88和TRIF通路激活TLR-4信号，驱动IL-6等促炎细胞因子的表达。

对于某些mRNA治疗药物类别，可控的佐剂活性可能是期望的，例如实现有效疫苗接种；而过度的炎症激活可能限制重复给药后的耐受性。因此，优化离子化脂质组成是LNP-based mRNA治疗药物开发的关键方向之一。研究人员此前已证明，含ALC-0315和SM-102组合、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000的LNPs可在体内提供高效mRNA递送和稳健的靶蛋白表达。然而，转染效率与LNPs的炎症活性谱并不一定直接相关。此外，动物模型中mRNA-LNP制剂重复给药的数据强调了评估第二次注射后反应的重要性。

本研究旨在全面评估含ALC-0315的空LNP-4和含ALC-0315/SM-102组合的空LNP-5在BALB/c小鼠两次肌内给药（间隔两周）后的促炎潜力。研究结合全身性、局部和器官水平的多组终点指标，以区分功能性炎症激活与结构性器官损伤。

二、主要技术方法

研究采用雌性BALB/c小鼠（7–8周龄，每组10只），分为LNP-4组、LNP-5组和安慰剂组。LNP-4为四组分制剂，含ALC-0315、DSPC、DMG-PEG2000和胆固醇（摩尔比46.3:9.4:1.6:42.7），粒径约59 nm；LNP-5为五组分制剂，含等摩尔ALC-0315/SM-102、DSPC、DMG-PEG2000和胆固醇（摩尔比23.15:23.15:9.4:1.6:42.7），粒径约86 nm。两种制剂均通过微流控装置制备，经透析纯化并在?80 °C冻存。给药剂量为4.004×10¹⁰颗粒/只，相当于含5 μg mRNA的mRNA-LNP制剂剂量，分两次60 μL间隔2小时注射，第二次注射在首次后14天进行。

主要技术方法包括：动态光散射测量粒径和多分散指数（PDI）；血液生化分析仪检测血浆参数（总蛋白、葡萄糖、尿素、肌酐、总胆固醇、AST/ALT活性）；组织学检查（苏木精-伊红染色和Mallory三色染色）评估肝脏、肌肉、肺和脾脏形态及纤维化；免疫组织化学（IHC）检测肝脏CD11b阳性细胞；免疫荧光（IF）检测TNFα、iNOS和CD11b表达；Western blotting定量下丘脑GFAP、S100β、TNFα和CD56蛋白水平；实时定量PCR（qPCR）检测各器官炎症、髓系、小胶质细胞、星形胶质细胞和紧密连接标志物的mRNA表达。统计分析采用Kruskal–Wallis检验及Dunn事后检验（Bonferroni校正）。

三、研究结果

3.1 体重、血液生化及注射部位组织学

首次注射后24和48小时，LNP-4和LNP-5组均出现显著体重下降（p < 0.05），安慰剂组无显著变化；第4天体重恢复至初始水平。第二次注射后24小时，两种LNP组再次出现显著体重下降。血液生化分析显示，LNP-4和LNP-5组尿素水平显著降低、总蛋白水平显著升高；LNP-4组胆固醇升高；LNP-5组AST/ALT比值升高。注射部位组织学显示，LNP-4和LNP-5组出现以中性粒细胞为主、少量淋巴细胞的中度细胞浸润，安慰剂组无明显浸润。

3.2 下丘脑炎症、髓系、小胶质细胞、星形胶质细胞及紧密连接标志物表达

LNP-4组下丘脑中Ptgs2、Il1b和Tnf mRNA水平较安慰剂显著升高，Nos2无差异；LNP-5组仅Ptgs2升高4倍（p = 0.0568，未达显著）。LNP-5组Itgam mRNA显著升高，Mrc1在两组均无变化。LNP-4组Cldn5和Tjp1 mRNA显著升高，Ocln无变化；Trem2 mRNA显著降低，Aif1和Gfap无变化。Western blot显示TNFα、CD56、GFAP和S100β蛋白水平在两组均无显著差异。

3.3 肝脏组织学、CD11b、TNFα和iNOS染色及炎症相关基因表达

两种LNP给药后肝脏均出现血窦毛细血管扩张伴炎症细胞浸润，但无纤维化、脂肪变性或肝小叶结构破坏。肝三联区血管和胆管面积在组间无显著差异。LNP-4组CD11b阳性细胞数和TNFα阳性染色面积较安慰剂显著增加，LNP-5组无显著变化；iNOS阳性面积组间无差异。LNP-4组Tnf、Nos2、Itgam和Mrc1 mRNA显著升高，其中Nos2显著高于LNP-5组；Ocln mRNA显著降低，Tjp1和Cldn5无显著变化。

3.4 肺和脾脏组织学、CD11b、TNFα和iNOS染色及基因表达

肺组织在包括安慰剂在内的所有组中均观察到血管充血、局灶性和弥漫性出血及小灶性肺泡水肿，LNP给药未加重这些变化，提示与麻醉和安乐死操作相关。LNP-4组肺中CD11b阳性细胞数显著增加，Il1b和Itgam mRNA显著升高；TNFα和iNOS染色面积及其余基因无显著变化。脾脏形态在所有组中无明显改变，LNP-4组TNFα阳性染色面积显著高于安慰剂，但Tnf和Il1b mRNA无显著变化；Ptgs2、Nos2、Itgam、Mrc1、Ocln和Tjp1 mRNA低于检测限。

四、讨论与结论

讨论部分总结： 两种LNP制剂均引起短暂的全身性和局部反应，包括体重下降、生化指标改变和注射部位细胞浸润。下丘脑Ptgs2 mRNA升高提示可能存在中枢反应组分，因COX-2诱导可增强前列腺素E₂合成，与发热、食欲减退和行为改变相关。但未观察到小胶质细胞或星形胶质细胞激活的证据。肝脏中LNP-4相关炎症标志物水平较高，可能反映离子化脂质组成差异：SM-102的酯键空间可及性较高，可能被更快水解清除，而ALC-0315滞留时间更长，可延长巨噬细胞和Kupffer细胞激活；此外，pKa差异（ALC-0315约6.09，SM-102约6.75）和表面电荷也可能影响细胞摄取和炎症反应。肺和脾脏反应有限，可能符合两种制剂优先在肝脏蓄积的分布特征。研究局限性包括仅使用雌性小鼠、样本量小、未进行盲法图像定量、未检测生物分布和蛋白冠组成等。

结论翻译： 所评估的两种脂质纳米颗粒制剂均伴随短暂的全身性和局部反应，包括体重变化、特定生化参数改变、炎症和髓系标志物变化以及注射部位细胞浸润。第二次给药后24小时，所检器官未见明显结构损伤。炎症标志物的变化在肝脏和下丘脑最为明显，而肺和脾脏反应有限。这些变化的强度和器官分布在不同制剂间存在差异，可能反映离子化脂质组成、粒径、制备条件和递送脂质剂量的差异。这些发现提示LNPs的组成可能影响其反应原性和器官特异性效应，在LNP-based疫苗递送系统的设计和安全性评价中应考虑此类差异。