《Pathophysiology》：Modeling Nontuberculous Mycobacterial Disease in Xenopus laevis
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由脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus，Mab）引起的非结核分枝杆菌（NTM）疾病全球发病率正在上升，其驱动因素包括诊断技术的改进，以及破坏土壤和水中天然储库的环境变化。这些破坏促进了水源系统的污染。免疫功能低下人群，尤其是患有囊性纤维
由脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus，Mab）引起的非结核分枝杆菌（NTM）疾病全球发病率正在上升，其驱动因素包括诊断技术的改进，以及破坏土壤和水中天然储库的环境变化。这些破坏促进了水源系统的污染。免疫功能低下人群，尤其是患有囊性纤维化（CF）或慢性阻塞性肺疾病（COPD）的患者，感染风险升高，尽管Mab也可感染其他健康个体，引起肺部及皮肤疾病。由于内在的抗生素耐药性以及标准抗结核方案疗效有限，临床管理仍面临挑战。尽管疾病负担日益加重，但调控Mab持续存在（persistence）与致病性的机制仍知之甚少。现有动物模型的局限性制约了研究进展。小鼠即使在免疫缺陷状态下通常也能迅速清除感染，限制了慢性疾病的研究。斑马鱼虽支持持续感染，但缺乏肺脏且适应性免疫系统发育程度较低。这些局限性凸显了对替代模型的需求。在此，研究人员提出一个观点，即两栖动物非洲爪蟾（Xenopus laevis）可作为研究Mab慢性感染与疾病的互补模型。X. laevis 蝌蚪早期即发育出功能性肺脏，并拥有保守的先天性和适应性免疫组分，包括巨噬细胞和抗原呈递通路。其体外发育特性允许对环境暴露进行精确控制，并具备实验可及性，如活体成像，从而可在超过50天内研究Mab感染。Xenopus 模型兼具斑马鱼在早期发育阶段实验可及性、遗传及转基因可操作性、以及成熟的动物饲养和分枝杆菌实验方案等特征，同时又拥有与哺乳动物保守的肺脏结构。研究人员讨论了应用 Xenopus 模型探究一个新型推定次级代谢产物基因簇（SMGC）潜在作用的研究前景，该基因簇被假设编码一种促进Mab定植、与巨噬细胞互作及持续存在的毒力因子。综上所述，这些特征确立了 X. laevis 蝌蚪作为解析宿主-病原体互作及识别潜在治疗干预靶点的宝贵实验平台。
主体内容总结
1. 引言
非结核分枝杆菌（NTMs）是一类与结核分枝杆菌（M. tuberculosis）和麻风分枝杆菌（M. leprae）复合群相似但又有区别的分枝杆菌。NTMs主要存在于土壤和水中，但正日益扩散至其自然生态位之外。极端天气事件和自然灾害对NTM自然储库的破坏可能通过气溶胶化杆菌增加暴露风险。全球NTM感染的发病率和患病率均呈上升趋势，但在资源有限地区，由于缺乏监测系统，NTM感染可能被低估。医疗和手术中塑料材料和植入设备的日益普及可能成为NTM感染的新诱因，因为NTMs可在医疗设备上形成生物膜。目前，包括脓肿分枝杆菌（Mab）在内的NTM暴露与疾病似乎与社会经济地位或地理位置无强关联。Mab是一种机会性人类病原体，主要感染肺功能受损的个体，如囊性纤维化（CF）和慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者，但健康个体也可通过开放性伤口感染引起皮肤病变。临床上，Mab感染表现类似结核病，在肺部形成结节和实变影，但Mab对抗结核药物耐药，使治疗极具挑战，常需联合抗生素方案，但可能因严重副作用或疗效不佳而调整或终止。尽管有临床试验探索噬菌体疗法，但Mab持续存在和致病机制仍不清楚，感染可能致命。传统上，小鼠被视为比较医学的“金标准”，但研究表明，健康及免疫缺陷小鼠（如IFNγ、NOS2和MyD88缺陷）均能快速清除Mab感染，难以研究慢性疾病机制。斑马鱼虽能支持慢性Mab感染，但缺乏肺脏且适应性免疫系统发育不完善。为弥合这两种模型的差距，研究人员提出两栖动物非洲爪蟾（Xenopus laevis）作为补充模型，其早期即拥有功能性肺脏及功能完善的先天性和适应性免疫系统。
2. 脓肿分枝杆菌是一种新兴病原体
Mab天然存在于土壤和水中，易在水生环境形成生物膜并附着于管道设施和灭菌不当的复用医疗设备表面，使其难以清除。Mab的独特性在于感染过程中可通过降低或丧失糖肽脂（GPLs）的表达改变形态。野生型光滑型（smooth）产生GPLs，而粗糙型（rough）不产生。GPLs的丢失常与细菌载量增加和更严重的疾病状态相关，但光滑型也可在慢性感染中持续存在。粗糙型和光滑型感染导致鼠巨噬细胞中宿主基因的差异性表达。GPLs的下调暴露了细菌抗原，如脂蛋白LpqH、LprA和LprG，这些脂蛋白可被宿主通过Toll样受体2（TLR-2）识别以启动免疫反应。病原体转变的关键常在于次级代谢产物的产生。次级代谢产物虽非生存必需，但在环境压力（如巨噬细胞内竞争或缺氧）下可促进生存，可作为毒素、抗生素、参与耐药性及调节氧化应激，在宿主体内可作为毒力因子或免疫逃逸机制。细菌间通过水平基因转移（HGT）交换遗传物质，主要机制包括转化、转导和接合，这些机制在环境NTM致病性演化中可能发挥重要作用。
3. 用于分枝杆菌研究的模型
研究人员简要总结了用于Mab感染致病机制研究的主要动物及组织模型的特征、优势与局限性。小鼠是典型的宿主-病原体研究模型，其免疫系统特征明确，肺脏生理结构与人类相似，包括分支支气管树和分叶肺。然而，传统免疫缺陷小鼠模型通常在数周内清除Mab感染，使用免疫抑制药物（如环磷酰胺和地塞米松）虽可允许定植，但不能完全模拟CF或COPD的慢性疾病状态。尽管如此，小鼠巨噬细胞研究仍揭示了粗糙型Mab感染可导致I型干扰素产生增加和炎症小体激活，以及Dectin-1在Mab进入巨噬细胞中的作用。其他小型哺乳动物如豚鼠对结核分枝杆菌高度易感，但针对Mab的研究有限；兔子虽能表现出人类结核病的空洞特征，但缺乏Mab研究的免疫学试剂。斑马鱼是分枝杆菌研究中成熟的脊椎动物模型，具有繁殖周期短、实验可及性好、透明度高适合活体成像等优势，并能维持包括Mab在内的慢性NTM感染。但斑马鱼等硬骨鱼无功能性肺脏，依靠鳃进行气体交换，不适合研究肺部环境中的宿主-病原体互作。此外，体外细胞培养系统也具有重要意义。永生化细胞系具有均一的遗传背景。THP-1细胞系源自白血病患者外周血，可分化为巨噬细胞，被广泛用于分枝杆菌研究，感染Mab光滑型或粗糙型表现出不同的转录组谱。U937细胞系源自组织细胞淋巴瘤患者，但与THP-1相比，其对结核分枝杆菌感染的生理相关性反应较弱。鼠源RAW264.7巨噬细胞系也用于阐明Mab毒力相关双组分系统及分枝杆菌胞内生存机制。
4. 非洲爪蟾作为人类免疫系统的模型
为推进NTM研究，研究人员提出两栖动物X. laevis作为弥补上述模型局限的交叉模型。与斑马鱼相似，X. laevis繁殖量大，幼体阶段透明，但与斑马鱼不同，其在出生五天后即拥有功能性肺脏。胚胎和蝌蚪独立于母体影响发育，便于在干扰因素较少的情况下研究免疫反应。X. laevis的免疫系统已被广泛表征，与人类高度保守，包括胸腺和脾脏、具有RAG介导重排的T细胞受体（TCRs）和免疫球蛋白（Ig）受体的T细胞和B细胞、AID介导的体细胞高频突变及Ig同型异质性、关键细胞因子及MHC I类和II类基因。T细胞成熟及关键表面分子表达在蛙类和哺乳动物间保守，MHC限制的细胞毒性T细胞和辅助T细胞反应已被证实。X. laevis及其近缘种X. tropicalis的基因组已完整测序和注释。在幼体早期，功能性先天免疫细胞如巨噬细胞和中性粒细胞在受精后一周内出现，功能性B细胞和T细胞在孵化后一周内出现。然而，多数T细胞为先天性样（i）T细胞，表达有限T细胞受体库，与非多态性非经典MHC-Ib（mhc1-uba）互作。表达恒定TCRα Vα45-J1.14重排并与mhc1-uba4或XNC4互作的iT细胞亚群已被证明对蝌蚪抵抗NTM海分枝杆菌（M. marinum）至关重要。在变态期间，胸腺和淋巴细胞数量急剧减少，免疫系统需生成新的淋巴细胞并经历另一轮阴性选择以建立对成年抗原的自我耐受。成年后，B细胞和T细胞受体库大幅多样化，抗体反应更高效。此外，可从蝌蚪和成体阶段收获腹膜白细胞用于离体建模，巨噬细胞可通过细胞分选技术分离，实验室中还可培养如肾脏来源的A6细胞系。
5. 非洲爪蟾作为成熟的分枝杆菌研究模型
研究人员实验室前期已利用海分枝杆菌（M. marinum）建立了X. laevis作为可靠的分枝杆菌实验生物。M. marinum广泛存在于淡水、咸水及鱼缸中，在水生动物中表现出与人类结核病相似的病理生理学，常被用作结核病模型。X. laevis的优势在于其转基因操作的便捷性。研究人员实验室开发了mpeg:GFP转基因品系，巨噬细胞表达绿色荧光蛋白（GFP），可通过共聚焦显微镜或流式细胞术追踪巨噬细胞募集及与病原体的共定位。利用这些转基因模型，研究发现蝌蚪和成体在感染M. marinum时表现出不同的宿主-病原体互作：蝌蚪呈耐受性，而成体则清除感染。qPCR、RNA测序、菌落形成单位、免疫组化、流式细胞术和共聚焦显微镜等均可用于量化宿主反应。研究人员还应用CRISPR/Cas9基因编辑结合转基因技术破坏关键免疫基因，包括非经典MHC-I、RAG2、FOXN1等，建立了免疫缺陷品系以加强体内研究。X. laevis模型也存在一些局限性，如抗体试剂库较小鼠有限，蝌蚪T细胞多样性较低且以先天性样T细胞为主，但后者也为研究先天性T细胞在宿主防御中的作用提供了独特机会。另一个需考虑的因素是感染温度差异，但X. laevis对微生物病原体的免疫反应组成和动力学与哺乳动物相当，且Mab作为环境分枝杆菌在室温下即可高效生长，支持其作为Mab感染模型的适用性。
6. 非洲爪蟾与脓肿分枝杆菌毒力的展望
基于M. marinum研究的成功，研究人员提出利用X. laevis研究Mab致病机制和慢性疾病。已有工作表明，X. laevis能对Mab感染产生免疫反应，包括在肺部表达IFNγ、TNFα和iNOS等炎症基因，与人类临床表现相似。Mab可在X. laevis蝌蚪中建立超过50天的慢性感染，并可能延迟变态。2009年Ripoll等人测序了首个Mab基因组，鉴定出多个可能源于远古HGT的基因簇。其中Mab_0248c-0305基因簇与链霉菌（Streptomyces）中负责抗生素次级代谢产物合成及铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）绿脓菌素（pyocyanin）生物合成的基因簇相似。分析显示，该Mab基因簇编码早期酶，但似乎合成3-羟基邻氨基苯甲酸，与Streptomyces albus的丝裂霉素（streptonigrin）生物合成途径共享。研究人员基于簇内其他基因提出了该次级代谢物的假设生物合成途径。已有数据支持该次级代谢物通路产生的化合物能触发宿主反应：当X. laevis蝌蚪感染该通路早期步骤基因（ΔphzC）缺失突变体时，感染部位巨噬细胞募集较野生型减少，且感染ΔphzC突变体的蝌蚪存活率显著提高，提示该次级代谢物可能作为毒力因子。但该通路促进宿主定植和持续存在的机制仍有待阐明。未来研究可利用尾鳍伤口接种系统，在mpeg::GFP转基因蝌蚪中通过活体共聚焦显微镜实时监测巨噬细胞募集及其被Mab感染的过程，并可追踪感染从尾部伤口向肺等远处器官的播散。蝌蚪肺脏整体制备相对容易，其体积小且透明，便于活体成像。
7. 结论
机会性病原体Mab正随着环境灾害和塑料/择期手术的增加而在全球范围内日益引起疾病。研究人员提出X. laevis作为小鼠和斑马鱼的互补模型生物，用于研究Mab/宿主互作，并认为X. laevis有望在阐明Mab致病机制方面做出重要贡献，从而推动未来更好的治疗策略。
