薯蓣皂苷通过激活Nrf2/HO-1信号轴减轻糖尿病肾脏疾病

《Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity》：Dioscin Alleviates Diabetic Kidney Disease via Activation of the Nrf2/HO-1 Signaling Axis

　　

摘要 背景：薯蓣皂苷（dioscin）作为一种天然甾体皂苷，虽已显示出肾脏保护作用，但其在糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease, DKD）中与核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）/血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）通路相关的机制尚未完全阐明。 方法：研究人员建立DKD大鼠模型并给予薯蓣皂苷治疗。检测代谢参数（血糖、尿蛋白、血清肌酐、肾脏指数）。通过苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin, H&E）染色、过碘酸-雪夫（Periodic Acid-Schiff, PAS）染色及透射电子显微镜评估肾脏组织病理学。采用免疫组织化学和免疫荧光评估Nrf2/HO-1表达及活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平。体外实验中，对高糖（high glucose, HG）诱导的HK-2细胞进行Nrf2敲低并给予薯蓣皂苷处理，检测细胞活力及ROS水平。 结果：薯蓣皂苷给药显著降低DKD大鼠空腹血糖60%、葡萄糖耐量40%、胰岛素水平50%、尿蛋白50%及血清肌酐水平35%（p<0.001），同时改善包括系膜增生和线粒体破坏在内的组织病理学损伤（p<0.001）。此外，薯蓣皂苷分别上调Nrf2和HO-1表达50%（p<0.01）和30%（p<0.05），并使肾脏ROS水平降低55%（p<0.001）。在高糖刺激的HK-2细胞中，薯蓣皂苷使细胞活力从55%提升至70%（p<0.001），ROS生成减少90%（p<0.001），线粒体ROS蓄积减少50%（p<0.001）。然而，Nrf2敲低逆转了上述保护效应。 结论：薯蓣皂苷通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻DKD中的肾损伤和氧化应激，凸显其作为DKD新型治疗药物的潜力。

糖尿病肾脏疾病中的氧化应激与Nrf2/HO-1通路：薯蓣皂苷保护作用机制解读

一、研究背景与科学问题

糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease, DKD）是全球慢性肾脏病的首要病因，约20%–40%的糖尿病患者会发展为DKD。其发病机制复杂且多因素交织，涉及高血糖、晚期糖基化终末产物蓄积、蛋白尿及脂质超载等血流动力学和代谢异常。氧化应激被公认为DKD发生与进展的关键决定因素——高血糖诱导的活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量产生直接损伤肾脏组分，同时激活JAK-STAT等炎症通路，促进促炎细胞因子释放，加剧肾损伤并推动纤维化和肾功能丧失。此外，线粒体功能障碍（包括氧化磷酸化和脂肪酸氧化受损）构成DKD发病的另一机制支柱。

核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）/血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）信号通路是细胞内抗氧化防御系统的核心调节枢纽。Nrf2作为该通路的"主开关"，在氧化应激时被激活并启动防御机制；HO-1作为关键抗氧化酶在Nrf2激活后被显著诱导，参与细胞保护。研究表明，Nrf2基因消融可加重糖尿病模型肾损伤，而药理学激活该通路可改善氧化损伤和肾功能。因此，调控Nrf2/HO-1通路被视为DKD干预的有前景策略。

当前DKD治疗策略主要集中于肾素-血管紧张素系统阻断剂（血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体阻滞剂），虽能有效减轻肾小球高压、降低蛋白尿并延缓肾功能恶化，但缺乏靶向抗氧化活性，且伴随高钾血症、急性肾损伤和泌尿生殖系统感染等不良反应，常影响患者依从性并限制疗效。因此，探索具有特异性抗氧化特性和良好安全性的替代药物具有重要临床意义。

薯蓣皂苷（dioscin）是从穿山龙（Dioscorea nipponica Makino）根茎中提取的甾体皂苷，具有抗炎、抗氧化、抗纤维化和代谢调节等多种药理活性。已有证据表明薯蓣皂苷可降低DKD动物模型的蛋白尿、改善肾功能并减轻肾纤维化。鉴于皂苷类化合物影响抗氧化通路的已知能力，以及薯蓣皂苷元在顺铂诱导急性肾损伤中通过激活Nrf2/HO-1通路减少ROS蓄积的观察结果，研究人员假设薯蓣皂苷在DKD中的肾脏保护作用可能由Nrf2/HO-1信号通路激活所介导。然而，直接支持Nrf2/HO-1轴参与薯蓣皂苷对DKD作用的证据仍然缺乏。本研究旨在探究薯蓣皂苷是否通过激活Nrf2/HO-1通路减轻DKD模型中的氧化应激和肾损伤，为其治疗潜力提供新的机制见解。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员采用高脂饮食联合链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）注射诱导SD大鼠DKD模型（造模大鼠随机分为Model组和Model+Dioscin组，正常饮食大鼠作为Control组），经8周灌胃给药（120 mg/kg薯蓣皂苷）后评估治疗效果。主要关键技术方法包括：代谢及肾功能参数检测（空腹血糖动态监测、腹腔葡萄糖耐量试验、胰岛素ELISA检测、24小时尿蛋白定量、血清肌酐检测及肾脏指数计算）；肾脏组织病理学与超微结构评估（苏木精-伊红染色、过碘酸-雪夫染色及透射电子显微镜观察）；免疫组织化学检测肾脏Nrf2/HO-1蛋白表达；免疫荧光检测肾脏ROS水平；体外HK-2人肾近端肾小管上皮细胞培养及高糖诱导损伤模型建立；shRNA介导的Nrf2基因敲低；MTT法检测细胞活力；DHE荧光探针检测细胞内ROS；MitoSOX Green流式细胞术检测线粒体ROS；Western blot和qRT-PCR检测蛋白及mRNA表达。

三、研究结果

薯蓣皂苷改善DKD大鼠代谢及肾功能参数： 通过8周动态血糖监测发现，Model组空腹血糖进行性升高，薯蓣皂苷给药显著降低血糖水平（p<0.001）；腹腔葡萄糖耐量试验显示薯蓣皂苷显著改善模型大鼠的葡萄糖耐量（p<0.001）；胰岛素水平检测显示Model组血清胰岛素升高，薯蓣皂苷治疗逆转了这一效应（p<0.001）。此外，Model组尿蛋白、血清肌酐和肾脏指数均显著高于Control组，薯蓣皂苷显著逆转了尿蛋白和血清肌酐的升高（p<0.001），但未改善肾脏指数升高。

薯蓣皂苷减轻DKD大鼠肾脏组织病理学及超微结构损伤： 苏木精-伊红染色显示Model组出现严重肾组织紊乱、炎性细胞浸润和结构损伤，薯蓣皂苷治疗后病理改变减轻；过碘酸-雪夫染色及定量分析显示Model组糖原蓄积和系膜区扩张显著，系膜面积和肾小球面积增加，薯蓣皂苷抑制了这一趋势（p<0.001）；透射电子显微镜显示Model组肾超微结构破坏（如线粒体损伤），薯蓣皂苷组恢复超微结构完整性。

薯蓣皂苷上调DKD大鼠肾脏Nrf2和HO-1表达： 免疫组织化学显示Nrf2和HO-1蛋白主要在肾小管区域表达，部分表达于肾小球区域，主要定位于细胞核。Model组Nrf2和HO-1染色强度较弱，薯蓣皂苷治疗显著增强了二者的染色强度（p<0.05），表明薯蓣皂苷激活了DKD肾脏中的Nrf2/HO-1通路。

薯蓣皂苷降低DKD大鼠肾脏ROS水平： 免疫荧光染色显示Model组ROS表达强烈（红色荧光），薯蓣皂苷治疗显著降低了Model+Dioscin组的ROS水平（p<0.05），表明薯蓣皂苷抑制了DKD肾脏中的ROS水平。

Nrf2介导薯蓣皂苷对HG诱导HK-2细胞损伤的保护作用： 通过shRNA敲低HK-2细胞Nrf2表达，qRT-PCR和Western blot确认shNrf2转染细胞中Nrf2 mRNA和蛋白表达较shNC对照显著降低50%（p<0.001）。MTT实验显示高糖显著抑制细胞活力，薯蓣皂苷治疗恢复细胞活力（p<0.001）；Nrf2敲低抵消了薯蓣皂苷的保护效应（p<0.01）。免疫荧光和MitoSOX Green流式细胞术数据显示，薯蓣皂苷抑制了高糖诱导的ROS产生和线粒体ROS蓄积（p<0.001），该效应被Nrf2敲低所逆转（p<0.05）。此外，高糖诱导的HO-1下调被薯蓣皂苷逆转，但该逆转效应被shNrf2部分削弱（p<0.001）。以上结果表明Nrf2是薯蓣皂苷介导的对抗高糖诱导ROS蓄积和细胞损伤保护作用的关键介质。

四、讨论与结论

讨论部分指出，DKD以糖代谢紊乱、肾功能指标异常和肾组织结构性损伤为特征，薯蓣皂苷发挥多方面保护作用。在血糖调节方面，薯蓣皂苷显著抑制DKD大鼠8周内进行性升高的空腹血糖，与山药及其提取物降糖益处的既往报道一致。在肾功能方面，薯蓣皂苷逆转了DKD模型大鼠尿蛋白和血清肌酐的升高，与薯蓣皂苷在狼疮性肾炎模型中降低这些参数的发现相符，提示广泛的肾脏保护潜力。然而，肾脏指数未见改善提示薯蓣皂苷可能主要促进功能恢复而非逆转晚期结构性损伤。在肾组织病理学和超微结构完整性方面，薯蓣皂苷减轻了肾组织紊乱和炎性浸润，减少了肾小球糖原沉积和系膜增生，并修复了线粒体结构。

氧化应激是DKD进展的关键驱动因素，Nrf2/HO-1通路构成对抗氧化损伤的核心防御机制。既往研究显示薯蓣皂苷可通过激活Nrf2/HO-1信号通路减少铁死亡和凋亡，在顺铂诱导的急性肾损伤中发挥保护作用。本研究通过机制研究和拯救实验阐明了薯蓣皂苷在DKD模型中由Nrf2/HO-1通路介导的抗氧化作用，并验证了Nrf2的关键作用。研究发现DKD大鼠肾组织中Nrf2/HO-1表达明显降低，薯蓣皂苷治疗显著增强其表达。体外实验中，Nrf2敲低削弱了薯蓣皂苷对高糖诱导细胞毒性和ROS蓄积的改善作用，明确确立了Nrf2作为关键介质。与此一致，既往分子对接研究显示薯蓣皂苷对Keap1（Nrf2的负调控因子）具有高结合亲和力，提示薯蓣皂苷可能直接与Keap1相互作用、抑制其功能、阻止Nrf2降解，从而激活Nrf2/HO-1通路。

研究局限性包括：抑制Nrf2减弱薯蓣皂苷在大鼠中肾脏保护功效的假设仍需后续动物实验验证；未直接测量Keap1/ARE活性；DKD进展还涉及炎症、纤维化、自噬功能障碍等机制，薯蓣皂苷是否通过Nrf2通路间接调节这些过程未予研究；动物和细胞模型可能无法完全再现人类DKD的病理生理复杂性；薯蓣皂苷的临床转化面临生物利用度有限、体内药代动力学特征不明确以及人类给药方案、有效剂量策略和长期安全性等问题。

结论：本研究证明薯蓣皂苷通过激活Nrf2/HO-1通路发挥抗氧化应激作用，恢复线粒体超微结构完整性，从而改善DKD模型中的肾损伤。这些保护效应在Nrf2敲除后被逆转，进一步确认其作为治疗介质的关键作用。鉴于目前缺乏直接靶向氧化应激的特异性疗法，这些发现凸显了薯蓣皂苷保护线粒体完整性和功能的潜力。通过减轻氧化损伤，薯蓣皂苷可作为辅助治疗支持DKD患者的长期肾功能，为Nrf2靶向临床干预提供实验证据。然而，由于这些发现基于临床前动物和细胞模型，在薯蓣皂苷可考虑用于糖尿病肾病临床治疗之前，仍需在更大规模动物研究和临床试验中进一步验证。