《Biological Psychiatry Global Open Science》：DUSP6 loss is associated with increased dopamine secretion and neurodevelopmental transcriptomic changes in ADHD iPSC-derived dopaminergic neurons
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背景：近期全基因组关联研究（GWAS）已将DUSP6鉴定为注意力缺陷多动障碍（ADHD）的遗传风险位点，然而其在ADHD易感性中的功能作用仍不清楚。已有证据表明，DUSP6可能通过限制突触多巴胺可用性来调节多巴胺能神经传递，鉴于多巴胺失调在ADHD风险生物学中
背景：近期全基因组关联研究（GWAS）已将DUSP6鉴定为注意力缺陷多动障碍（ADHD）的遗传风险位点，然而其在ADHD易感性中的功能作用仍不清楚。已有证据表明，DUSP6可能通过限制突触多巴胺可用性来调节多巴胺能神经传递，鉴于多巴胺失调在ADHD风险生物学中的核心作用，这一机制具有合理性。然而，目前在人类神经元系统中尚缺乏直接的机制证据。本研究在人类同源多巴胺能模型中检测了DUSP6扰动的影响。方法：研究人员利用CRISPR-Cas9技术，从一名ADHD个体构建了同源诱导多能干细胞（iPSC）系，包括杂合子和纯合子DUSP6敲除系以及亲本对照系。将这些iPSC系分化为高纯度（>99%）的多巴胺能神经元，并在细胞水平和转录组水平进行评估。结果：研究人员观察到细胞外多巴胺随DUSP6基因剂量呈显著增加，纯合子敲除系的升高幅度大于杂合子敲除系。RNA测序进一步支持了这一发现，显示DUSP6敲除与调控多巴胺分泌及突触过程的基因表达增加相关，这些过程对多巴胺能系统至关重要。除多巴胺信号外，转录组变化还提示DUSP6参与了ADHD易感性的核心神经发育过程。此外，研究人员发现DUSP6调控的基因与重度抑郁症、双相情感障碍和精神分裂症相关的基因存在显著重叠，代表了可能受DUSP6影响的共享神经发育通路。结论：本研究为DUSP6可能通过影响多巴胺信号和神经发育通路而促进ADHD易感性提供了机制见解，同时强调了其在相关神经精神疾病中的更广泛意义。
研究背景与问题
注意力缺陷多动障碍（ADHD）是一种常见的神经发育障碍，其病因学中长期假设多巴胺失调处于核心地位，精神兴奋类药物正是通过调节多巴胺信号并增加突触多巴胺可用性来发挥作用的。近期大规模全基因组关联研究（GWAS）已将双特异性磷酸酶6（DUSP6）鉴定为ADHD的遗传风险位点，但DUSP6如何通过分子机制促进ADHD风险仍未完全阐明。DUSP6编码一种双特异性磷酸酶，能够去磷酸化磷酸丝氨酸/苏氨酸和磷酸酪氨酸残基，并通过调控激酶活性参与多种细胞过程，包括多巴胺能神经传递的调节。此前研究表明，DUSP6可通过下调L型电压门控钙通道CACNA1C抑制多巴胺释放，以及稳定原发性多巴胺转运体SLC6A3增加多巴胺再摄取，从而降低突触多巴胺水平。此外，单细胞图谱分析显示DUSP6在发育中人脑的兴奋性神经元和成神经细胞中高表达，而在星形胶质细胞中表达较低。基于上述背景，研究人员提出假设：在ADHD个体的多巴胺能神经元中下调DUSP6将导致突触多巴胺水平增加。本研究旨在利用CRISPR-Cas9技术构建同源DUSP6敲除iPSC系，分化获得多巴胺能神经元，通过定量细胞内和细胞外多巴胺浓度、评估转录组变化及钙成像等手段，探究DUSP6在ADHD病理生理学中的作用机制。
研究方法概述
研究人员采用CRISPR-Cas9技术靶向DUSP6外显子1，从一名男性ADHD青少年来源的iPSC系成功构建了杂合子（Het）和纯合子（Hom）敲除克隆，经Sanger测序确认编辑正确性，并通过Western印迹验证蛋白表达缺失。随后，利用慢病毒诱导法表达ASCL1、LMX1B和NURR1因子，将三种基因型的iPSC系分化至DIV35，获得纯度>99%的多巴胺能神经元，并通过免疫细胞化学确认酪氨酸羟化酶（TH）和MAP2表达。分别进行了：多巴胺ELISA检测（使用ALPCO试剂盒定量细胞内和细胞外多巴胺浓度）、RNA测序（Ribo-Zero Plus文库制备，Illumina NovaSeq X Plus平台双端测序，约5000万读段/样本，nf-core/rnaseq流程比对至GRCh38，limma-voom进行差异表达分析）、钙成像（Fluo-8负载，ISIM显微镜记录基线及KCl刺激后钙信号变化），以及DUSP6差异表达基因与GWAS鉴定的ADHD、精神分裂症（SCZ）、重度抑郁症（MDD）、双相情感障碍（BD）风险基因的重叠分析（基于MAGMA v1.08和100,000次置换检验）。
研究结果
CRISPR工程与功能验证：研究人员成功获得两个DUSP6敲除克隆，Het为单等位基因破坏，Hom为双等位基因破坏，Sanger测序和PHYRE2蛋白结构预测均证实了相应突变及构象改变，Western印迹确认了基因剂量依赖的DUSP6蛋白减少。分化后的神经元TH阳性率>99%，同时表达MAP2，且表达A9/黑质致密部和A10/腹侧被盖区样多巴胺能神经元的相关标记物（如KCNJ6、ALDH1A1、CALB1、OTX2），而非神经元群体的典型标志物（GFAP、OLIG2、AIF1、PECAM1）几乎不表达。
DUSP6敲除揭示的差异表达基因（DEGs）：亲本与Hom比较共鉴定出514个DEGs（|log2FC|≥2），前10位主要为细胞外基质（ECM）和细胞粘附分子（COL1A2、COL4A2、FBN1、TNC、CDH6）及ECM相关/分泌型神经发育调节因子（IGFBP7、FSTL1、SEMA3C、ANOS1、FKBP10）。Het与Hom比较及亲本与Het比较分别鉴定出77个和25个DEGs，功能上与前者重叠，涉及神经发生、多巴胺能神经元存活及神经元兴奋性相关基因。进一步定义的DUSP6剂量响应DEGs共2,352个（1,499个下调，853个上调），其中前10位上调基因中有8个参与突触传递和多巴胺信号（GRIK2、SLC24A2、HPCAL4、INSYN2A、PTPRN、PRKACB、CAMK2N1、SSTR1），而下调基因主要为神经发生相关基因。基因富集分析显示，上调基因高度富集于神经递质突触运输和神经发育通路，下调基因则主要富集于ECM组织和发育过程。
DUSP6敲除以基因剂量依赖性方式增强多巴胺分泌且独立于钙通道改变：线性趋势分析显示，细胞外多巴胺在亲本、Het和Hom三组间呈显著递增趋势（p=0.015），其中Hom相比亲本显著升高（p=0.016），而细胞内多巴胺无显著变化。转录组数据中，与多巴胺分泌调控和神经递质运输相关的DEGs在三组间呈现从亲本到Het再到Hom的递增表达模式。值得注意的是，CACNA1C表达未上调，钙成像也未显示基线或诱发的钙振幅在各基因型间存在显著差异，提示细胞外多巴胺升高是由突触释放机制的基因上调驱动，而非钙通道功能改变所致。
DUSP6敲除DEGs与其他主要精神疾病风险基因的重叠：亲本与Hom比较的DEGs与BD（p=7.0×10-5）、MDD（p=1.0×10-5）和SCZ（p=1.0×10-5）的风险基因存在显著重叠，均达到Bonferroni校正阈值。尽管与ADHD风险基因的重叠在置换检验中名义显著，但未通过多重检验校正。然而，各疾病的倍数富集程度相近（ADHD为1.35倍，BD为1.36倍，MDD为1.36倍，SCZ为1.38倍），ADHD置信区间较宽因其GWAS基因集较小。重叠基因的富集分析显示，BD重叠基因富集于质膜和细胞外周，SCZ重叠基因富集于神经系统发育和突触组织，MDD重叠基因富集于轴突导向和神经元投射形态发生，均指向神经发育和神经元结构通路。
讨论与结论
本研究揭示了DUSP6基因在ADHD病理生理学中的潜在作用，特别是通过其对多巴胺能神经传递的影响。研究发现DUSP6对多巴胺信号具有基因剂量依赖的调控效应，敲除后细胞外多巴胺呈线性上升趋势，与转录组数据一致。上调的DUSP6剂量响应DEGs多编码突触机器组件或调控因子（如INSYN2A、PTPRN、SLC24A2、GRIK2、SSTR1、HPCAL4、PRKACB、CAMK2N1），突出了DUSP6在突触水平调控多巴胺信号功能的作用。此外，DUSP6还作为神经发育的重要调节因子发挥作用，下调基因多为ECM和细胞粘附分子（COL1A2、TNC、FBN1、ANOS1、IGFBP7、CDH6），这些分子在神经突生长和轴突导向中发挥重要作用，且胶原合成和组装基因先前已在TWAS研究中与ADHD显著相关。DUSP6敲除DEGs与MDD、BD和SCZ风险基因的重叠，结合Brainstorm联盟报告的精神疾病间广泛的遗传相关性，提示DUSP6相关的转录变化可能作用于跨诊断的神经发育轴，而非仅限于ADHD的特异性机制。值得注意的是，钙通道方面，DUSP6上调可下调CACNA1C，但本研究发现反向并不成立，可能与之前研究在大鼠PC12细胞系中进行而本研究在人多巴胺能神经元中进行有关。研究局限性包括：仅使用单一供体的iPSC系、每种编辑基因型仅一个克隆、神经元呈现胎儿样中脑多巴胺能表型而非成熟A9/A10亚型、bulk RNA-seq无法排除微量非神经元群体或细胞组成差异。结论：本研究通过人类神经元模型加深了对GWAS鉴定的ADHD风险基因分子基础的理解，强调了DUSP6作为多巴胺能神经传递和神经发育调节因子的重要性，未来应利用CRISPRi/CRISPRa滴定或CRISPR敲入方法探索SNP水平效应，并研究DUSP6调控的下游信号通路以确定ADHD治疗的潜在靶点。
