塞尔维亚三个地区野生食肉动物外寄生虫与媒介传播病原体的多样性：Hepatozoon canis、Babesia canis与Bartonella rochalimae的分子检测及系统发育分析

《Veterinary Sciences》：Diversity of Ectoparasites and Vector-Borne Pathogens in Wild Carnivores: Evidence from Three Regions of Serbia

　　

野生食肉动物可在野生动物—家养动物—人类交界处维持外寄生虫与媒介传播病原体。研究人员对2022年10月至2023年1月在塞尔维亚三个地区采样的金豺（Canis aureus）、赤狐（Vulpes vulpes）、欧洲獾（Meles meles）与欧洲野猫（Felis silvestris）的外寄生虫及若干媒介相关病原体进行了鉴定。在受检的122只动物中，77只携带外寄生虫；共采集68只蜱与254只蚤。蜱包括蓖麻硬蜱（Ixodes ricinus）（n = 37，其中n = 23来自C. aureus，n = 14来自V. vulpes）、网纹革蜱（Dermacentor reticulatus）（n = 23，其中n = 12来自C. aureus，n = 11来自V. vulpes）、扇头蜱属（Rhipicephalus spp.）（n = 3，其中n = 2来自C. aureus，n = 1来自V. vulpes）与刻点血蜱（Haemaphysalis punctata）（n = 5，其中n = 2来自C. aureus，n = 3来自V. vulpes）；蚤包括犬栉首蚤（Ctenocephalides canis）（n = 171，其中n = 97来自C. aureus，n = 64来自V. vulpes，n = 9来自Meles meles，n = 1来自Felis silvestris）、猫栉首蚤（C. felis）（n = 36，其中n = 14来自C. aureus，n = 12来自V. vulpes，n = 10来自Meles meles）、人蚤（Pulex irritans）（n = 25，其中n = 15来自C. aureus，n = 6来自V. vulpes，n = 4来自Meles meles）、鸡角叶蚤（Ceratophyllus gallinae）（n = 21，其中n = 5来自C. aureus，n = 16来自V. vulpes）与印鼠客蚤（Xenopsylla cheopis）（n = 1，来自C. aureus）。分子筛查在6份蜱样本中检出犬肝簇虫（Hepatozoon canis）DNA，在3份蜱样本中检出巴贝虫属（Babesia spp.）DNA，在13份蚤样本中检出巴尔通体属（Bartonella spp.）DNA；其余细菌、原虫与病毒靶标均未检出。Sanger测序获得的序列分别归属于犬巴贝虫（Babesia canis）（n = 2）、H. canis（n = 4）与罗氏巴尔通体（Bartonella rochalimae）（n = 13）。系统发育分析将本研究序列与相关欧亚参考谱系归为一类。上述发现记录了塞尔维亚野生食肉动物多样化的外寄生虫群落及媒介相关病原体的循环，并支持采用宿主—媒介配对采样开展持续性的One Health监测。

研究背景方面，野生食肉动物是森林、城郊与城市生态系统的重要组成部分，可参与媒介传播病原体的维持与循环，其利用包括邻近人类聚居地在内的多种生境的能力，增加了与家养动物、人群及节肢动物媒介接触的机会。塞尔维亚拥有犬科、猫科与鼬科等多样化的食肉动物区系，金豺（Canis aureus）与赤狐（Vulpes vulpes）分布广泛，欧洲獾（Meles meles）与欧洲野猫（Felis silvestris）亦为该国野生动物的重要组成部分；金豺在塞尔维亚显著扩张并频繁利用人类改造景观，赤狐易于占据城郊生境，这些生态特征使野生食肉动物处于自然与人为环境的交界处，成为外寄生虫的相关宿主及病原体传播循环的潜在参与者。硬蜱（Ixodidae）因不同发育阶段可侵袭不同宿主而尤为重要，塞尔维亚已确立硬蜱属（Ixodes）、革蜱属（Dermacentor）、血蜱属（Haemaphysalis）与扇头蜱属（Rhipicephalus）；蚤（Siphonaptera）同样具有重要的兽医与公共卫生意义，栉首蚤属（Ctenocephalides）等种类被认定为包括巴尔通体属（Bartonella spp.）与猫立克次体（Rickettsia felis）在内细菌性病原体的媒介，同时可作为犬复孔绦虫（Dipylidium caninum）的中间宿主；塞尔维亚既往对175只赤狐的调查显示32%的动物存在蚤感染，鉴定出C. felis、C. canis、C. globiceps与Pulex irritans。除病原体传播外，重度外寄生虫感染可导致失血、皮肤损伤与炎症反应，并可能对动物健康与保护产生更广泛影响。既有研究表明塞尔维亚及欧洲其他地区的野生食肉动物可携带多种媒介传播病原体，塞尔维亚野生犬科动物研究已记录蜱与包括嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum）、暂定种新埃立克体（Candidatus Neoehrlichia mikurensis）及伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）狭义群成员在内的人兽共患病原体，金豺与赤狐亦被视为塞尔维亚媒介传播疾病监测的有用哨兵物种。然而，尽管关于塞尔维亚野生动物蜱传感染的信息不断增加，有关外寄生虫多样性及蚤相关病原体的数据仍相对有限，尤其是同时研究多种野生食肉动物与多个病原类群时更为如此。因此本研究旨在鉴定塞尔维亚三个地区金豺、赤狐、欧洲獾与欧洲野猫采集的外寄生虫，并对所获节肢动物筛查选定的细菌、原虫与病毒性媒介传播病原体，所调查病原包括A. phagocytophilum、Anaplasma platys、Babesia spp.、Bartonella spp.、Cytauxzoon felis、Ehrlichia canis、Hepatozoon canis、蜱传脑炎病毒（TBEV）与西尼罗病毒（WNV）。

主要技术方法方面，野生食肉动物于2022年10月至2023年1月采自塞尔维亚斯雷姆地区Stara Pazova、贝尔格莱德地区Ugrinovci与布兰尼切沃地区Veliko Gradi?te的狩猎场，标本来源于当地狩猎协会与贝尔格莱德自然历史博物馆的合作，采样经塞尔维亚共和国环境保护部批准（编号353-01-667/2022-04与353-01-668/2022-04）。研究人员通过梳毛法采集外寄生虫，依据欧洲与北非蜱类鉴定指南进行蜱的形态学鉴定，依据Orange County Mosquito and Vector Control District蚤类图解检索表进行蚤的形态学鉴定，标本保存于70%乙醇并于+4 °C存放至多三个月。单只外寄生虫在300 μL磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.2）中以5 mm金属珠及Tissuelyser II匀浆，按地点与种类混合，每池至多10只，阳性池中的外寄生虫再逐只检测；DNA采用IndiSpin Pathogen Kit提取，蜱RNA采用PureLink RNA Mini Kit提取。分子检测靶向WNV、TBEV、A. phagocytophilum、A. platys、Babesia spp.、Bartonella spp.、C. felis、E. canis与H. canis，采用已发表的引物/探针系统与扩增方案，其中A. phagocytophilum、A. platys、E. canis、TBEV与WNV采用实时荧光定量PCR/逆转录实时荧光定量PCR（qPCR/RT-qPCR），Babesia、Bartonella、Cytauxzoon与Hepatozoon靶标采用常规PCR结合凝胶电泳。阳性产物经纯化后在贝尔格莱德大学生物学院进行Sanger测序，序列经FinchTV检查、于MEGA环境组装，并以BLAST（Version 5）与GenBank序列比较；系统发育树在MEGA12中采用最大似然法（Maximum Likelihood）与Tamura-Nei替代模型重建，启发式搜索的初始树通过邻接法（Neighbor-Joining）与BioNJ算法自动获得，并保留最高对数似然值的拓扑结构。

研究结果方面，3.1 采样动物与外寄生虫：共检查122只野生食肉动物，包括67只金豺、43只赤狐、10只欧洲獾与2只欧洲野猫，从77只动物（43只金豺、27只赤狐、6只欧洲獾与1只欧洲野猫）中回收到外寄生虫，共采集68只蜱与254只蚤。蜱鉴定包括I. ricinus、D. reticulatus、H. punctata与Rhipicephalus spp.，因并非所有标本均能明确确认至种，部分以属级报告；蚤鉴定出5种：P. irritans、Ctenocephalides canis、C. felis、Xenopsylla cheopis与Ceratophyllus gallinae。从4种野生食肉动物共采集隶属9个分类单元的322只外寄生虫标本，蚤较蜱更为丰富，分别占254只（78.9%）与68只（21.1%）；蜱中以I. ricinus记录最多（n = 37），其次为D. reticulatus（n = 23）、H. punctata（n = 5）与Rhipicephalus spp.（n = 3）；优势蚤种为Ctenocephalides canis（n = 171），其次为C. felis（n = 36）、P. irritans（n = 25）、C. gallinae（n = 21）与X. cheopis（n = 1）；外寄生虫标本数最多者为C. aureus（n = 171），其次为V. vulpes（n = 127）、M. meles（n = 23）与F. silvestris（n = 1）；蜱仅见于C. aureus与V. vulpes，而蚤见于全部4种宿主。3.2 媒介传播病原体检测：在6份蜱样本中检出H. canis特异性DNA，13份蚤样本中检出Bartonella spp. DNA，3份蜱样本中检出Babesia spp. DNA；未检出A. phagocytophilum、A. platys、E. canis、C. felis、TBEV或WNV特异性核酸。标本层面记录显示，H. canis DNA见于布兰尼切沃地区金豺与赤狐的5只I. ricinus与1只Rhipicephalus蜱；Babesia阳性记录包括来自金豺的2只D. reticulatus与来自赤狐的1只I. ricinus，均来自布兰尼切沃；Bartonella阳性蚤记录主要来自布兰尼切沃（12份），1份来自斯雷姆，包括C. canis与P. irritans。3.3 Sanger测序与系统发育分析：3份Babesia阳性扩增产物中有2份获得的序列在系统发育上与B. canis聚类；获得4条Hepatozoon canis序列与13条Bartonella序列，Bartonella序列与B. rochalimae高度一致；H. canis序列与源自土耳其、斯洛伐克与塞尔维亚的参考序列完全相同，Babesia sp.序列与来自欧洲及其他地理区域的B. canis参考序列聚类，BLAST分析显示B. canis序列最大核苷酸一致性为98.8%；代表性系统发育树分别基于Babesia spp.部分18S rRNA序列、Hepatozoon spp.部分18S rRNA序列以及Bartonella spp. 16S–23S rRNA基因间间隔区序列构建，后者纳入B. henselae、B. vinsonii、B. clarridgeiae、B. elizabethae与B. taylorii等巴尔通体种进行比较。

讨论部分总结指出：本研究记录了塞尔维亚三个地区野生食肉动物的外寄生虫多样性及若干媒介相关病原体，122只受检动物中77只回收到外寄生虫，蜱与蚤均包括具有兽医与人兽共患意义的类群；Ixodes、Dermacentor、Haemaphysalis与Rhipicephalus蜱与Ctenocephalides、Pulex蚤共存，符合塞尔维亚相互重叠的森林、家域周边与家养传播界面。由于研究采样对象为外寄生虫而非系统检测每只宿主的血液或组织，分子结果代表节肢动物材料中的病原体检出而非宿主水平感染率。研究局限包括采样期仅覆盖2022年10月至2023年1月的秋冬季，无法全面评估外寄生虫发生的季节性变化，且各宿主物种样本量差异较大，限制了关于种间外寄生虫多样性与宿主关联差异的可靠结论。金豺与赤狐外寄生虫占优势与塞尔维亚及中欧邻国既往观察一致，既往研究记录了塞尔维亚赤狐多样化的硬蜱群落，并将金豺持续扩张与野生动物、家养动物及其外寄生虫接触机会增加相联系；本材料记录4个蜱分类单元与5种蚤，Ctenocephalides canis为最丰富蚤种，中欧其他地区赤狐亦报告有相似的多样化蜱蚤区系，支持适应性强的野生犬科动物可在森林、城郊与人为生境中维持外寄生虫群落的观点。布兰尼切沃3只蜱检出Babesia DNA，2份扩增产物序列归属B. canis；2份阳性标本为来自金豺的D. reticulatus（B. canis的主要欧洲媒介），1份为来自赤狐的I. ricinus；野生犬科动物为Babesia spp.的已知宿主，值得注意的是来源序列分析报告B. canis最大相似性为92.86%并与B. canis参考序列系统发育聚类，可能源于所得序列质量较低，但结果仍与邻国序列聚类并被纳入分析，建议对相应扩增产物重新测序以确认。Bartonella PCR产生的阳性分子结果最多，标本层面数据以C. canis为主，亦包括P. irritans，测序鉴定为B. rochalimae而非B. henselae；Bartonella sp.为家养动物与野生动物的媒介相关细菌，蚤可参与其生态学，B. rochalimae序列在系统发育分析中与参考序列聚类；在金豺与赤狐蚤类中的检出在野生动物—家养动物—人类交界处具有流行病学意义，但其本身并不能证明脊椎动物宿主的储存宿主能力或蚤种的媒介能力。H. canis DNA在来自金豺与赤狐的蜱中检出，4份扩增产物序列归属H. canis；脊椎动物H. canis感染通常经摄入感染蜱而非蜱叮咬接种而发生，扇头蜱属为已确立的媒介，因此本研究从I. ricinus中回收H. canis DNA仅表明所采蜱中存在病原体DNA，并不能确立媒介能力；系统发育分析将塞尔维亚H. canis序列与来自塞尔维亚、斯洛伐克与土耳其的参考条目归为一类，支持密切相关H. canis谱系的区域连续性。B. canis、H. canis与Bartonella spp.的联合检出与既往显示这些病原在食肉动物相关宿主—媒介系统中循环的报道一致；应特别关注B. rochalimae，因其具有公认的人兽共患意义，且巴尔通体感染已在动物与人类中被记录；本研究所得序列与其他欧洲及欧亚地点参考序列的密切系统发育关系，符合相关谱系更广泛的地理循环，野生动物宿主的移动与节肢动物媒介分布的变化可能促成此类模式，尤其在日益城市化与城郊化的环境中。所检材料中未检出A. phagocytophilum、E. canis、C. felis、WNV与TBEV，应谨慎解读，有限样本中未检出某病原并不能排除其在该更广区域的循环，尤其因媒介活动与感染压力可随季节与地理变化；金豺在塞尔维亚的持续扩张与生态适应性进一步支持整合野生食肉动物、其外寄生虫以及在可行时结合家养动物与人类健康数据的综合监测价值，该框架符合应对新发传染病的更广泛One Health理念与人兽共患威胁防范准备。所检蜱中未检出WNV或TBEV RNA，A. phagocytophilum、A. platys、E. canis与C. felis亦未检出，这些阴性结果不应被解读为塞尔维亚不存在这些病原的证据，该国已记录WNV与TBEV循环且其他媒介传播病原体存在于野生动物中；此外，所用检测针对C. felis，而欧洲野生猫科动物已知携带不同的Cytauxzoon种，这可能进一步降低两只受检野猫的检出概率；解读受限于地理覆盖范围有限、宿主样本量不等、混合检测、野猫与獾数量极少以及缺乏配对的标准化宿主血液/组织检测。未来研究应结合单只外寄生虫检测与匹配宿主样本、更广的季节与地理覆盖以及对所有阳性检出的基于序列的确认，此类设计将有助于更稳健地估计感染率，并更清晰地区分病原体携带、储存宿主状态与媒介能力。

研究结论部分翻译为：来自斯雷姆、贝尔格莱德与布兰尼切沃的野生食肉动物携带多样化的蜱与蚤组合。分子检测检出H. canis、Babesia spp.与B. spp.，测序鉴定出H. canis、B. canis与B. rochalimae。系统发育分析将本研究序列与相关欧亚参考谱系相联系。上述发现支持对塞尔维亚野生动物及其外寄生虫开展持续性的以One Health为导向的监测，重点在于宿主—媒介配对采样、在可行时采用单只而非混合的分子检测，以及能够区分病原体携带与真正储存宿主或媒介能力的序列确认。