《Veterinary Sciences》：Rapid Detection and Differentiation of Staphylococcus hyicus and Non-hyicus Staphylococci Using a Novel Duplex Real-Time Polymerase Chain Reaction
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渗出性皮炎（Exudative Epidermitis, EE），亦称仔猪油皮病，主要由产毒素的猪葡萄球菌（Staphylococcus hyicus）引起，但非猪葡萄球菌如S. chromogenes和S. sciuri也被认为参与了EE的暴发。尽管已有多种
渗出性皮炎（Exudative Epidermitis, EE），亦称仔猪油皮病，主要由产毒素的猪葡萄球菌（Staphylococcus hyicus）引起，但非猪葡萄球菌如S. chromogenes和S. sciuri也被认为参与了EE的暴发。尽管已有多种聚合酶链式反应（PCR）或实时荧光定量PCR（qPCR）方法用于检测S. hyicus及部分葡萄球菌种，但目前尚无能够同时检测并区分S. hyicus与非猪葡萄球菌的双重qPCR（duplex qPCR, dqPCR）方法。为此，研究人员开发了一种新型dqPCR检测方法，可在一个反应体系中快速、差异化地检测S. hyicus与非猪葡萄球菌。所开发的dqPCR方法能够检测葡萄球菌分离株，并将S. hyicus与非猪葡萄球菌区分开来。该方法对两种靶标的检测限（Limit of Detection, LOD）均为5 × 102 CFU/mL，在标准化条件下比参考qPCR和常规PCR（cPCR）方法的LOD低10倍。在对来自临床EE病例的104个细菌分离株进行的临床评估中，该dqPCR方法准确检出了所有57个葡萄球菌分离株，并特异性地将14株S. hyicus从非猪葡萄球菌分离株中区分出来，与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的结果达到100%一致。鉴于其较短的周转时间、高特异性及灵敏度，本研究新开发的dqPCR方法将在猪场临床中用于筛查和鉴别S. hyicus与非猪葡萄球菌方面具有重要应用价值。
研究背景与目的
渗出性皮炎（Exudative Epidermitis, EE）又称仔猪油皮病，是一种对仔猪具有重大经济影响的皮肤病，主要表现为广泛性渗出、脱水、生长迟缓和死亡率升高。猪葡萄球菌（Staphylococcus hyicus）是该病的主要病原体，通过产生剥脱性毒素破坏表皮完整性。然而，越来越多的证据表明，其他葡萄球菌种，包括金黄色葡萄球菌（S. aureus）、产色葡萄球菌（S. chromogenes）和松鼠葡萄球菌（S. sciuri，最新分类学中称为Mammaliicoccus sciuri），也可作为原发性病原体或机会性继发病原体参与EE病变。虽然幼龄仔猪的EE临床诊断通常较为直接，但对于年龄较大的猪只或不典型病例，需要通过细菌学确认以将EE与其他皮肤病（如疥螨病、皮肤真菌病、锌缺乏相关性角化不全及玫瑰糠疹）进行鉴别。传统的病因学诊断依赖于细菌分离培养后采用生化方法或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行菌种鉴定，但这些方法劳动强度大、耗时长，且可能缺乏足够的辨别力来可靠地区分S. hyicus与其近缘或共感染的葡萄球菌种。分子诊断技术的进步促进了常规PCR（cPCR）和实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法的发展。已有多个针对16S rRNA或tuf基因保守区的qPCR方法用于葡萄球菌属水平的检测，以及多个针对sodA基因的cPCR方法用于S. hyicus的种特异性检测。尽管如此，目前尚无一种qPCR方法能实现S. hyicus的种特异性检测，更无能在单一反应中同时检测并区分S. hyicus与非猪葡萄球菌的双重qPCR（duplex qPCR, dqPCR）方法。因此，本研究的目的是开发一种新型dqPCR方法，实现对S. hyicus和非猪葡萄球菌的同步检测与鉴别，并使用来自患病猪EE病变部位的细菌分离株对其诊断性能进行评估。
研究方法概述
研究人员使用了来自先前研究的两株S. hyicus田间菌株（SHY2512-1和SHY2512-2）以及从韩国机构获取的24株细菌标准菌株用于特异性评估。临床样本来自两个养猪场的24头患有EE的猪只，经培养纯化后获得104个细菌分离株，并通过MALDI-TOF MS进行鉴定。核酸提取采用自动化磁珠法平台。引物探针设计方面，分别以延伸因子Tu编码基因（tuf）和超氧化物歧化酶A编码基因（sodA）为靶标，设计了葡萄球菌属特异性（SG）和S. hyicus种特异性（SH）两套引物-探针组。其中SG探针标记FAM/BHQ1，SH探针标记Texas Red（TR）/BHQ2，以实现双通道同步检测。研究人员优化了dqPCR的反应条件，并进行了特异性、灵敏度（检测限，LOD）、精密度（批内和批间变异系数）以及在混合菌群中的检测性能评估。同时，以先前报道的qPCR方法和cPCR方法作为参考进行性能比较。
研究结果
3.1 dqPCR方法的解读
dqPCR成功地在单一反应中同时检测到tuf基因的FAM信号和sodA基因的TR信号。在所有测试的9株葡萄球菌中均检测到FAM信号，而TR信号仅在2株S. hyicus中检出，在17株非葡萄球菌中两种信号均未产生。dqPCR对tuf和sodA基因的扩增效率分别为96.35%和100.25%，与相应的单重qPCR相当。
3.2 dqPCR方法的特异性
S. hyicus特异性引物-探针组仅在S. hyicus菌株中产生阳性TR信号，在24株非目标菌株（包括7株非猪葡萄球菌和17株非葡萄球菌）中均未检出。双重检测中，两株S. hyicus菌株同时产生了FAM和TR信号，未观察到通道间的荧光串扰。
3.3 dqPCR方法的灵敏度
通过对S. hyicus菌液进行10倍梯度稀释检测，确定dqPCR对tuf和sodA基因的检测限（LOD）均为5 × 102 CFU/mL，与单重qPCR一致。在统一使用40个扩增循环的条件下，参考qPCR和cPCR方法的LOD均为5 × 103 CFU/mL。因此，本研究开发的dqPCR方法的LOD比参考方法低10倍。
3.4 dqPCR方法的精密度
使用高、中、低三种浓度的S. hyicus菌液进行批内和批间精密度评估。批内变异系数（CV）对于tuf基因为0.48%-1.08%，对于sodA基因为0.02%-0.67%；批间CV对于tuf基因为0.22%-1.21%，对于sodA基因为0.11%-2.15%。结果表明该方法具有良好的重复性和再现性。
3.5 dqPCR方法在混合菌群中的表现
在包含不同比例S. hyicus与非猪葡萄球菌的混合菌群实验中，所有混合条件下的SG和SH靶标均被检出，Ct值均低于阳性判定阈值（≤38）。即使在S. hyicus处于低浓度（接近LOD）而其他非猪葡萄球菌处于高浓度的情况下，S. hyicus仍能被稳定检出，平均SH Ct值与S. hyicus单独对照相比增加不到一个循环。
3.6 dqPCR方法的临床诊断性能
使用dqPCR对104个从EE病变部位分离的细菌菌落进行检测，结果显示：57个菌落（54.8%）为tuf基因阳性（即葡萄球菌属），其中14个菌落（13.5%）同时为sodA基因阳性（即S. hyicus）。这些结果与参考qPCR和cPCR方法的结果完全一致（Cohen‘s kappa系数κ=1.0）。MALDI-TOF MS鉴定结果进一步证实了所有57个tuf阳性菌落均为葡萄球菌属物种，包括S. aureus（n=15）、S. chromogenes（n=2）、S. cohnii（n=1）、S. epidermidis（n=3）、S. haemolyticus（n=8）、S. hominis（n=1）、S. hyicus（n=14）、S. pasteuri（n=4）、S. sciuri（n=8）和S. simulans（n=1），而14个sodA阳性菌落全部为S. hyicus。其余47个菌落在所有PCR检测中均为阴性，并被鉴定为非葡萄球菌物种。
讨论与结论
讨论部分指出，葡萄球菌是猪体内的共生菌和机会致病菌，与包括EE在内的多种感染相关。准确的病因学诊断需要能够可靠区分S. hyicus与其他葡萄球菌的诊断工具。本研究选择tuf基因作为属水平检测靶标，选择sodA基因作为S. hyicus种特异性鉴定靶标，是基于它们各自的优越性：tuf基因在低GC含量革兰氏阳性菌中为单拷贝必需基因，且在低丰度样本中检测效果优于16S rRNA；sodA基因则具有较高的序列变异性，能有效区分葡萄球菌种。该dqPCR方法具有四个主要优势：一是高分析特异性，通过简并碱基的设计实现了对多种猪源葡萄球菌的广谱检测；二是高灵敏度，其LOD（5 × 102 CFU/mL）比参考方法低10倍；三是能够在混合菌群中同时检测并区分S. hyicus和其他葡萄球菌；四是操作简便快捷，从细菌分离后的DNA制备到扩增完成约需2-5小时，对于不具备MALDI-TOF MS条件的实验室而言是一个实用且经济的替代方案。研究也存在局限性：该方法的性能评估是基于培养后的细菌分离株，尚未在直接从EE病变标本中提取的DNA上进行验证；混合菌群评估仅限于三种非猪葡萄球菌和选定的浓度组合；此外，EE病例中发现的葡萄球菌多样性也提示未来需要开发能同时检测其他临床相关菌种（如S. aureus、S. haemolyticus和S. sciuri）的扩展多重检测方法。
结论翻译： 尽管存在上述局限性，该dqPCR方法在检测和区分S. hyicus与非猪葡萄球菌方面表现出优异的诊断性能。因此，该dqPCR方法是快速、准确鉴定导致猪EE及其他葡萄球菌感染的病原体的有价值工具。尽管如此，仍需进一步研究将该方法的应用扩展到无需预先培养即可直接检测临床样本。
