《Veterinary Sciences》：Respiratory Pathogen Co-Detection in Hospitalised Cats: A Molecular and Clinical Study in a Biological Isolation and Containment Unit
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摘要
呼吸道疾病是猫发病的重要原因，可能涉及多种呼吸道病原体的同时检出。然而，住院猫中呼吸道病原体共检出的频率与模式，以及与多病原检出相关的临床特征，目前仍缺乏充分描述。本研究利用分别靶向SARS-CoV-2以及细菌、真菌和病毒性呼吸道病原体的单重与多重实时荧
摘要
呼吸道疾病是猫发病的重要原因，可能涉及多种呼吸道病原体的同时检出。然而，住院猫中呼吸道病原体共检出的频率与模式，以及与多病原检出相关的临床特征，目前仍缺乏充分描述。本研究利用分别靶向SARS-CoV-2以及细菌、真菌和病毒性呼吸道病原体的单重与多重实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法，对2023年3月至2024年5月期间收治于某生物隔离与收容单元（Biological Isolation and Containment Unit, BICU）的150只猫的呼吸道样本进行了分析，以表征呼吸道病原体的共检出情况。研究人员通过共检出矩阵（co-detection matrix）描述了成对呼吸道病原体的共检出模式，并采用多元逻辑回归（multiple logistic regression）分析识别与多呼吸道病原体检出独立相关的因素。研究共记录到189次呼吸道病原体检出事件。多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）是最常检出的微生物（n = 118；78.7%），其次是猫支原体（Mycoplasma felis）（n = 29；19.3%）。150只猫中有48只（32.0%）出现多呼吸道病原体检出，且该现象与入院首要原因为猫呼吸道疾病综合征（feline respiratory disease complex, FRDC）以及入院时感染性疾病分类独立相关。多杀性巴氏杆菌是成对呼吸道病原体共检出中最常涉及的微生物。上述发现为住院猫群体中呼吸道病原体的发生与共检出模式提供了基线分子与临床数据，可为后续流行病学研究提供支持。
论文解读
一、研究背景与目的
呼吸道病原体是影响家猫的最重要感染性因素之一，在猫呼吸道疾病综合征（feline respiratory disease complex, FRDC）的病因学中发挥核心作用。FRDC是一种多因素综合征，涉及感染因子、宿主易感性与环境因素之间的相互作用，可影响疾病的表现与严重程度。传统上，猫疱疹病毒1型（FHV-1）和猫杯状病毒（FCV）被认为是与FRDC相关的主要病毒病原体，而猫支原体（Mycoplasma felis）、猫衣原体（Chlamydophila felis）和支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）则是公认的加重疾病严重程度与持续性的细菌性致病因素。机会性细菌如多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）也常在猫上呼吸道检出，但分子检出本身无法区分其作为共生定植与活跃参与致病过程的情况。
目前，大多数流行病学研究集中于收容所猫群、流浪猫或混合门诊队列，专门针对需在生物隔离设施中住院的猫群的研究较少。住院猫代表了一类临床异质性群体，常伴有并发疾病、免疫受损或感染状态不确定等情况，构成一个无法与社区群体直接比较的独特流行病学群体。此外，兽医医院是易感动物群体、兽医人员和医院环境持续互动的复杂临床环境，可能促进病原体的引入、循环与持续存在。因此，本研究旨在：表征某兽医教学医院生物隔离与收容单元（BICU）中住院猫呼吸道病原体的分子流行病学特征；确定呼吸道病原体检出与共检出的频率和模式；评估病原体检出与临床特征之间的关联。
二、研究设计与方法
本研究为一项回顾性横断面观察研究，于2023年3月至2024年5月在葡萄牙里斯本大学兽医学院教学医院BICU开展。研究期间共有208只猫收治于BICU，其中150只（72.1%）符合纳入标准。研究人员从电子病历中回顾性提取人口统计学与临床信息，包括年龄、性别、品种、逆转录病毒状态、入院首要原因、主要主诉及相关临床发现。呼吸道样本于入院时或住院24小时内采集，每只猫分别采集口咽黏膜和结膜黏膜拭子各一支，置于RNAlater?稳定液中于-80 °C保存。采用DNeasy Blood & Tissue Kit提取总核酸。病原体检测使用四种商业分子检测试剂盒：一种SARS-CoV-2单重逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测试剂盒和三种GCani?猫呼吸道多重检测面板，分别靶向细菌、真菌和病毒病原体。Ct值≤40（GCani?面板）或Cq值<40（SARS-CoV-2）判定为阳性。此外，在45份样本亚组中进行了内源性β-actin实时PCR检测以评估可扩增宿主DNA。统计分析包括Shapiro–Wilk正态性检验、Student's t检验或Mann–Whitney U检验、Pearson's χ2检验或Fisher精确检验，以及多元逻辑回归分析。
三、研究结果
3.1 基本特征
在具有完整人口统计学和临床数据的148只猫中，多数为雄性（64.2%）和家养短毛猫（88.5%），约半数年龄在2至10岁之间（48.0%）。入院时，44.6%被归类为感染性疾病，30.4%为疑似感染性疾病，25.0%为非感染性疾病。疑似逆转录病毒病是最常见的入院首要原因（59.5%），其次为FRDC（25.0%）。在逆转录病毒状态方面，52.7%检测阴性，21.6%为疑似或不确定状态，25.7%为FIV、FeLV或两者阳性。
3.2 呼吸道病原体分子检出
150只住院猫中共记录189次呼吸道病原体检出事件。细菌病原体占检出的大部分。多杀性巴氏杆菌是最常检出的微生物，在118只猫（78.7%）中检出，其次为猫支原体（29只；19.3%）。猫衣原体和卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）各在3只猫（2.0%）中检出，而支气管败血波氏杆菌和巴尔通体属（Bartonella spp.）未检出。真菌病原体中，曲霉属（Aspergillus spp.）在3只猫（2.0%）中检出。病毒病原体中，FHV-1和FCV分别在17只（11.3%）和16只（10.7%）猫中检出。猫呼肠孤病毒、甲型流感病毒和SARS-CoV-2均未检出。内源性β-actin检测在45份样本中的41份（91.1%）呈阳性。
3.3 呼吸道病原体检出模式
150只住院猫中有129只（86.0%）检出至少一种呼吸道病原体。81只猫（54.0%）检出单一呼吸道病原体，48只猫（32.0%）检出两种或以上病原体（即多病原检出），21只猫（14.0%）未检出任何呼吸道病原体。
3.4 呼吸道病原体共检出模式
在48只多病原检出的猫中，多杀性巴氏杆菌是最常参与成对共检出的微生物，最常与猫支原体共同检出（27只猫；占研究总体的18.0%），其次为FCV（13只；8.7%）和FHV-1（12只；8.0%）。涉及猫衣原体、卡他莫拉菌和曲霉属的共检出较少见。共记录73次成对共检出事件。
3.5 逆转录病毒状态与呼吸道病原体检出的关联
在未校正多重比较时，FIV阳性与较低的多杀性巴氏杆菌检出频率存在名义显著关联（57.9% vs. 84.6%；OR = 0.26，95% CI: 0.07–0.89；p = 0.022），但经Benjamini–Hochberg校正后不再显著（校正p = 0.404）。校正后未发现FIV或FeLV状态与个体呼吸道病原体检出或共检出之间存在显著关联。
3.6 单一与多呼吸道病原体检出的临床特征比较
多病原检出组入院时被归类为感染性疾病的比例显著高于单病原检出组（54.2% vs. 34.2%；p = 0.032），且因FRDC入院的比例也显著更高（41.7% vs. 16.5%；p = 0.003）。多病原检出组的住院时间显著长于单病原检出组（中位数4天 vs. 3天；p < 0.001）。年龄组分布、性别、逆转录病毒状态及血液学变量在两组间无显著差异。
3.7 多元逻辑回归分析
在纳入127只猫的多元逻辑回归模型中，FRDC作为入院首要原因（aOR = 2.68；95% CI: 1.03–6.98；p = 0.044）和入院时感染性疾病分类（aOR = 3.73；95% CI: 1.24–11.25；p = 0.019）与多呼吸道病原体检出显著独立相关。年龄组、性别和逆转录病毒状态与多病原检出无显著关联。Hosmer–Lemeshow检验未提示模型拟合不良（χ2 = 9.77，df = 8，p = 0.281）。
四、讨论与结论
本研究有三项主要发现：细菌性呼吸道病原体在检出微生物中占主导地位，多杀性巴氏杆菌检出频率最高；约三分之一的猫存在多呼吸道病原体检出；FRDC作为入院首要原因和入院时感染性疾病分类与多病原检出独立相关。多杀性巴氏杆菌的高检出频率需谨慎解读——其既是猫口腔和上呼吸道的共生菌，也是机会性病原体，分子检出不能作为其致病作用的直接证据。多病原检出与FRDC及感染性疾病分类的关联提示，病原体共检出在感染性疾病背景下的住院猫中可能更为常见，这与FRDC作为多因素综合征的现代概念一致。
逆转录病毒状态与呼吸道病原体检出或共检出之间未发现统计学显著关联，但这不排除逆转录病毒感染对呼吸道病原体易感性或检出的潜在影响，样本量有限可能限制了检测效能。本研究的主要优势在于将分子诊断与结构化临床分类系统相结合，提供了比单独考虑病原体检出更稳健的分子诊断结果解读。多病原检出组住院时间略长（中位数相差1天），但其临床意义尚不确定。
从转化临床角度看，多重分子诊断不应仅被视为病原体鉴定工具，而应作为表征采样时呼吸道病原体群落的补充手段，其临床价值取决于与病史、临床检查、流行病学背景和标准化临床表型分类的整合。本研究还展示了兽医医院群体中产生的分子数据在One Health框架下的潜在价值，多杀性巴氏杆菌的高检出率凸显了在生物隔离设施中采取适当感染预防措施和职业生物安全的重要性。甲型流感病毒和SARS-CoV-2均未检出，但核酸提取方法并非针对RNA回收优化，阴性结果需谨慎解读。
本研究存在若干局限性：横断面设计无法确定因果关系；核酸提取系统主要针对DNA纯化，可能影响RNA病毒检测灵敏度；口咽和结膜拭子合并处理，无法将病原体检出归因于特定解剖部位；PCR检出无法区分活动性感染与无症状携带、短暂定植或既往感染后的残留核酸；DTRSF临床分类未经正式验证；单中心设计限制了结果的普适性。
结论：本研究提供了BICU住院猫呼吸道病原体的全面分子表征，显示细菌病原体占主导地位，多病原检出在该临床高风险群体中较为常见。多病原检出与FRDC入院原因和感染性疾病分类独立相关。研究强调分子检出结果应在临床和流行病学背景下解读，而非作为孤立的实验室发现，并为未来纵向监测研究和One Health框架下的哨点监测应用提供了基线数据。
