《Veterinary Sciences》：Molecular Characterization of IS1111-Positive Tick Pools from Punjab, Pakistan Reveals Clade C Coxiella-like Endosymbionts
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Coxiella burnetii是Q热（Q fever）的病原体，是一种重要的人兽共患病原体。蜱中C. burnetii的分子检测具有挑战性，因为蜱常携带遗传相关的Coxiella-like endosymbionts（CLEs，类柯克斯体内共生菌），后者在
Coxiella burnetii是Q热（Q fever）的病原体，是一种重要的人兽共患病原体。蜱中C. burnetii的分子检测具有挑战性，因为蜱常携带遗传相关的Coxiella-like endosymbionts（CLEs，类柯克斯体内共生菌），后者在靶向共享遗传标记的检测中可能呈阳性。在牲畜种群密集的巴基斯坦，关于蜱中C. burnetii的可靠数据缺乏。研究人员对2013年至2014年间在巴基斯坦旁遮普邦从家养反刍动物采集的387个蜱池（Hyalomma spp.和Rhipicephalus spp.）进行了回顾性分子调查。采用序贯诊断方法，包括先用IS1111和icd qPCR（quantitative real-time PCR，定量实时PCR）初筛，随后对IS1111和16S rRNA基因进行PCR扩增和测序以开展系统发育分析。此外，评估了与其他蜱传病原体的共检出情况。IS1111 qPCR阳性蜱池的总比例为1.3%（5/386个可评估池；95% CI（confidence interval，置信区间）：0.5–3.0）。所有IS1111阳性蜱池经icd qPCR均为阴性。IS1111元件测序在三个池中成功，16S rRNA基因测序在两个池中成功。16S rRNA基因的系统发育分析将两个已测序池鉴定为Clade C CLE，而IS1111序列未能区分C. burnetii与CLE。其余三个IS1111 qPCR阳性池无法在分类学上得到解决。Ehrlichia spp. DNA在一个CLE确认池（Hy. anatolicum）中共存，Anaplasma marginale DNA在一个未解决的IS1111 qPCR阳性池（Rh. turanicus）中共存。在所研究地区采样期间检查的蜱池中未确认到C. burnetii DNA。研究结果强化了确认性测序和多位点方法在准确区分C. burnetii与CLEs中的重要性。此外，结果提示，仅基于IS1111检测的报告应谨慎解读，并强调需要进一步研究以阐明C. burnetii的发生及蜱在其生态学和传播中的作用。
研究背景与问题：Coxiella burnetii（C. burnetii）是Q热（Q fever）的病原体，具重要人兽共患意义；家养反刍动物被认为是主要储存宿主，但蜱在自然传播循环中的作用仍有争议。蜱常携带与C. burnetii亲缘接近的Coxiella-like endosymbionts（CLEs，类柯克斯体内共生菌），后者可在靶向IS1111插入元件（IS1111 insertion element）或16S rRNA基因（16S rRNA gene）等共享标记的分子检测中扩增，导致误判和高估蜱中C. burnetii流行率。巴基斯坦牲畜密集，蜱传病原研究重要，但C. burnetii蜱类分子数据有限且多仅基于IS1111，缺乏区分CLEs的确认。为此，研究人员重新分析2013—2014年巴基斯坦旁遮普邦家养反刍动物存档蜱池，采用多位点分子方法区分C. burnetii与CLEs，提供分子和系统发育证据，以提高Coxiella DNA检测解释准确性。
关键方法：样本为2013年9月至2014年6月巴基斯坦旁遮普省两个农业生态区108个农场351只家养反刍动物（牛、水牛、山羊、绵羊）的387个存档蜱池，原始蜱样本来自柏林自由大学寄生虫学与热带兽医研究所，采集、形态鉴定和混池见既往研究；经质量控制排除18个原始池。蜱按种和宿主个体混池。方法包括IS1111和icd qPCR筛查、IS1111与16S rRNA基因PCR扩增及测序、最大似然法（maximum likelihood）系统发育分析、BLASTn和p距离（p-distance）比较，并回顾性交叉参照其他蜱传病原PCR及反向线点杂交（reverse line blot hybridization，RLB）数据；以蜱池为分析单位，用广义估计方程（generalized estimating equation，GEE）估计农场聚类95% CI。
3.1. Detection of Coxiella DNA in Tick Pools Using IS1111 qPCR：通过IS1111 qPCR筛查386个可评估蜱池（1池因抑制排除），5池阳性，总池阳性率1.3%（95% CI 0.5–3.0）。按蜱种，Hy. anatolicum为1.1%（3/286），Rh. microplus为1.2%（1/85），Rh. turanicus为11.1%（1/9），6个Hyalomma dromedarii池无阳性。按宿主，山羊为5.9%（3/51），牛为0.6%（1/166），水牛为0.6%（1/167），绵羊2池无阳性。阳性池分布于Kasur、Bahawalpur、Multan、Khanewal和Rahim Yar Khan五个地区；因阳性数少，仅作描述性总结。
3.2. Phylogenetic Characterization of IS1111-Positive Tick Pools：通过icd qPCR及IS1111、16S rRNA基因测序和系统发育分析，5个IS1111阳性池经icd qPCR均为阴性；3池获得IS1111序列，2池获得16S rRNA基因序列，另有两池序列质量不合格或未获目标扩增。IS1111序列与C. burnetii RSA 493一致性为99.7–99.9%，与Clade C CLE KT345175一致性为99.2–99.6%，不能区分C. burnetii与CLE。16S rRNA基因序列与Clade C CLE一致性为97.8–99.2%，与C. burnetii为94.4–95.2%，并在系统发育树中聚类于Clade C CLE；22QC1441和22QC1523判定为Clade C CLE，22QC1560、22QC1650和22QC1707未获分类学解决。
3.3. Co-Occurrence of Coxiella DNA with Other Tick-Borne Pathogens：通过回顾性交叉参照其他蜱传病原数据，5个IS1111阳性池中2池共检出其他病原：22QC1523（Hy. anatolicum）共检出Ehrlichia spp.，22QC1707（Rh. turanicus）共检出Anaplasma marginale。因检测单位为混池，不能说明两种微生物存在于同一蜱；A. marginale DNA可能来自残留宿主血。
讨论部分总结：CLEs与C. burnetii遗传相似，IS1111单靶标检测可因交叉反应造成假阳性并高估C. burnetii；icd为单拷贝靶标，分析灵敏度较低，其阴性结果需谨慎解释。IS1111不宜视为蜱中C. burnetii的特异标记，IS1111阳性样本应通过16S rRNA基因等区分性位点测序确认。低阳性比例可能与混池稀释及长期保存导致DNA数量和质量下降有关，而非CLEs低流行。未确认C. burnetii DNA不排除研究区存在该菌，既往环境IS1111检测和家畜血清学证据支持其发生。与仅依赖单靶标检测的巴基斯坦早期研究相比，本研究通过16S rRNA基因确认CLE；与近期包含测序确认的研究一致。蜱种、宿主和地区估计因阳性池少而统计不确定性大；共检出不代表同蜱共感染。局限性包括回顾性近12年储存可能致DNA降解、β-actin内控可扩增宿主和蜱DNA、混池降低分析灵敏度、仅能报告池阳性比例、部分序列基于单读长、16S rRNA基因在Coxiella属内分辨率有限、阳性数少限制风险因素统计功效，以及历史样本不一定反映当前流行病学状况。
结论翻译：总之，本研究为巴基斯坦旁遮普省家养反刍动物采集的两个蜱池中的Clade C CLEs提供了分子证据。尽管五个蜱池经IS1111 qPCR呈阳性，但五个受检池中有三个未确认C. burnetii DNA。这些发现强调，将敏感筛查试验与具有区分能力的分子标记相结合，以区分CLEs与C. burnetii并降低高估蜱中C. burnetii发生风险的重要性。研究的回顾性性质及样本年龄限制了这些发现对巴基斯坦当前流行病学状况的提示程度。总体而言，结果支持在未来监测研究中使用稳健的多位点分子方法。
