《Human Fertility》：Evaluation of prolonged in vitro incubation of human sperm at room temperature
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## 摘要
单次射精所得精子的存活率与活力的体外存续时间鲜有研究。人类精子在常温体外环境下的生理性衰变仍属关键但探索不足的领域。标准临床操作通常仅涉及精子的短期处理，而新技术的开发要求对精子的"货架期"有更深入的认识。本项先导性研究旨在通过纵向评估精子活力、
## 摘要
单次射精所得精子的存活率与活力的体外存续时间鲜有研究。人类精子在常温体外环境下的生理性衰变仍属关键但探索不足的领域。标准临床操作通常仅涉及精子的短期处理，而新技术的开发要求对精子的"货架期"有更深入的认识。本项先导性研究旨在通过纵向评估精子活力、存活率及DNA碎片化来刻画人类精子在常温下的存续特征，并评价培养液更换能否延长精子体外活力。研究人员收集了26份精子浓度≥15百万/ml且活力≥40%的精液样本，并采用非连续密度梯度离心法浓缩活动精子。其中20份样本用于评估活力与存活率的纵向动态变化。为建立DNA损伤的时间曲线，研究人员采用上游法（swim-up）于第0、3、6、9和12天（D0、D3、D6、D9、D12）收集处理后的样本。其余6份样本在更换与不更换培养液两种条件下，采用计算机辅助精液分析（CASA）观察精子活力参数。初始处理后，样本的基线活力为91.2±3.4%，存活率为94.6±3.5%。在20天孵育期间，精子活力与存活率均呈时间依赖性下降，且活力下降较存活率更快。活力平均持续13.4天。20份样本在D20的存活率为13.4±4.4%。在10份完成存活率全程观察的样本中，存活时长为35–50天。前向运动精子的DNA碎片化水平在D3（2.4±1.4%）和D6（5.7±5.8%）与D0（3.9±2.8%）相比无差异，但在更晚的时间点，前向运动精子的DNA碎片化升高，D9达9%（p=0.003）、D12达11.2%（p=0.01）。此外，定期更换培养液的处理后精子表现出活力存续时间的延长。本先导性研究显示，经常规体外处理并置于常温下的人类精子，其活力存续时间为8–18天，存活率存续时间为35–50天，尽管D9之后前向运动精子显示出显著增加的DNA损伤。定期更换培养液可支持并延长精子活力的存续时间。
**关键词**：精子活力；存活率；DNA碎片化；计算机辅助精液分析（CASA）
## 论文主体解读
**一、研究背景与问题**
人类精子在女性生殖道内可存活至多7天，并维持约5天的受精能力。精子存活率反映其结构完整性，存活精子具有完整膜结构与正常细胞功能；精子活力则指精子前向运动的能力，只有活动精子才能穿越女性生殖道抵达卵母细胞。二者共同构成自然受孕与辅助生殖技术（assisted reproductive techniques，ART）中受精潜能的关键指标。然而，单次射精所得精子在常温下活力与存活率能维持多久，研究相对不足。
自Appell等于1960年首次证实人类精子可在化学限定培养液中存活数日并维持活力以来，后续研究优化了孵育条件，发现常温优于4°C或37°C用于精子活力的短期体外保存。未处理精液中活力在3天内迅速下降，而存活率可维持至2周；精液洗涤处理可显著延长精子存续时间，活力维持至3周、存活率维持至6周。多数置于常温的制备样本在14天后仍保有活力，部分样本活力超过20天；常温保存5天的制备精子仍能成功受精人卵母细胞。近年研究发现，采用无电解质培养液制备精子，于4°C下存活精子可存在至7周。这些结果提示，在适宜培养条件下（常温、营养补充、去除精浆），精子体外存续时间可获延长。
精子DNA碎片化（sperm DNA fragmentation，SDF）已成为男性不育评估的常用生物标志物。尽管SDF与ART结局的关联尚不一致，一项近期荟萃分析报告，78项纳入研究中66%显示SDF升高对ART结局有不良影响。然而，迄今少有研究考察长时间孵育过程中SDF的时间变化。Rougier等（2013）显示，非连续梯度浮力密度离心后SDF随时间升高，初始SDF高的样本在3小时后尤易显著升高；相反，处理后精子在25°C下24小时后DNA完整性可与基线相当。Aksoy等（2013）也证实，24小时后精子DNA完整性与原始样本相当。但长时间孵育期间、尤其前向运动精子群体内的SDF动态，仍认识不足。
除SDF外，精子体外功能存续还显著受环境稳定性影响。活性氧（reactive oxygen species，ROS）和乳酸等代谢副产物在长时间孵育中可能对精子有害。通过更换培养液补充能量底物并清除代谢物，被视为环境维持策略；已有研究显示磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）中精子活动可能由内源性底物支持，而外源性底物可延长精子功能窗口。因此，周期性环境优化或有助于在长时间孵育中调控精子功能。
人类精子在常温体外环境下的生理性衰变仍是生殖医学中关键但探索不足的领域。标准临床操作多涉及精子短期处理，而先进精子选择、体外成熟（in vitro maturation，IVM）及先进诊断检测等新技术的发展，要求更深入了解精子的"货架期"。为弥补这些知识空白，本研究旨在通过纵向评估活力、存活率和DNA碎片化来刻画人类精子在常温下的存续特征，以更全面理解体外精子存活与基因组稳定性随时间的变化；并进一步评价通过更换培养液进行环境维持能否为临床操作中延长体外精子管理提供线索。
**二、主要技术方法**
研究经香港中文大学及新界东联网临床研究伦理委员会（CUHK-NECT CREC）批准（编号2016.499），所有参与者均签署书面知情同意。共收集26份精液样本，均符合浓度≥15百万/ml、活力（MOT）≥40%的纳入标准，按世界卫生组织（WHO）第6版精液分析手册操作；其中20份用于纵向评估活力、存活率和DNA碎片化，6份用于计算机辅助精液分析（CASA）观察。样本先经非连续密度梯度浮力密度离心处理，以G-MOPS plus培养液（含人血清白蛋白5 mg/ml和庆大霉素）洗涤并重悬。20份样本调整至约5百万精子/ml后在常温实验室环境保存，每日晨间轻摇重悬后评估活力，存活率采用伊红–苯胺黑（1:1）染色评估。SDF于D0、D3、D6、D9、D12经离心取上清前向运动精子，用HaloSperm G2试剂盒评估，每张玻片评估≥300条精子。6份样本经相同洗涤处理并稀释至10百万精子/ml，分为不更换培养液组与每3天更换G-MOPS plus培养液组，采用LensHooke X1 Pro精液质量分析仪（Bonraybio，软件版本X1.E006）评估活力参数。数据分析中，连续变量以均数和标准差（SD）表示；因部分样本在D9或D12活力为0%造成缺失值，SDF跨时间差异采用混合效应模型检验；培养液条件、孵育时间及其交互作用对CASA参数的影响采用双因素重复测量方差分析，并以Geisser-Greenhouse校正处理时间因素内的球形性违背；均为双侧检验，p<0.05为有统计学意义，使用GraphPad Prism（9.5.1）完成分析与绘图。
**三、研究结果**
**精子活力与存活率的存续时间。** 共20份精液样本用于评估精子活力与存活率的存续时间。处理后D0的平均精子活力与存活率分别为91.2±3.6%和94.6±3.5%。在20天孵育期间，活力与存活率均呈时间依赖性下降，活力下降快于存活率。精子活力持续8–18天，平均13.4天，其中55%的样本活力维持13–14天。D20时20份样本平均存活率为13.4±4.4%。因样本量不足，仅10份样本完成长期存活率评估，这些样本存活率持续35–50天，尽管活力已完全丧失。
**精子DNA碎片化的变化。** 研究对处理后样本中前向运动精子于D0、D3、D6、D9和D12评估SDF。D0平均SDF为3.9±2.8%。孵育3天后SDF无显著变化（2.4±1.4%，p=0.09）；D6 SDF虽升至5.7±5.8%，但与D0相比差异未达统计学意义（p=0.45）。相反，存续时间延长的前向运动精子SDF显著升高，D9达9.0±6.2%（n=18，p=0.003），D12达11.2±6.4%（n=10，p=0.01）；样本量随时间减少系因部分样本不再含前向运动精子。
**采用CASA观察精子活力参数的变化。** 其余6份样本经CASA进一步刻画活力变化，比较定期更换与不更换培养液的孵育条件。不更换培养液时，精子活力由D0的84.3%降至D13的0%；尽管D12仍可检出前向运动精子，但D6后快速运动消失。速度参数——平均路径速度（VAP）、直线速度（VSL）、曲线速度（VCL），以及线性度（LIN=VSL/VCL）、直线性（STR=VSL/VAP）和摆动性（WOB=VAP/VCL）——均呈总体下降趋势并伴间歇性波动。侧头位移幅度（ALH）呈类似波动，而拍击交叉频率（BCF）相对稳定，前8天在4.9–7.0 Hz之间，无明确时间趋势。定期更换培养液时，样本活力由D0的86.3%降至D17的6.7%，D10后下降更明显；前向运动精子至D17仍可检出，快速运动在D16后消失。VAP、VSL、VCL、LIN、STR和WOB均呈伴波动的缓慢下降趋势；ALH无一致方向性趋势；与不更换条件类似，BCF至D14保持稳定，为6.5–7.8 Hz。为全面评价培养液更换对精子活力模式随时间的影响，研究人员进行双因素方差分析，结果显示培养液条件（列因素）除对慢速前向运动（p=0.2738）外，对所有参数均有显著影响，表明更换培养液有效保持了精子活力；几乎所有运动学参数均检出交互效应（时间×处理），从统计学上表明更换培养液可减缓精子运动学指标的退化。
**四、讨论与结论**
讨论指出，本研究评估了常温下精子活力与存活率的体外存续时间，并考察常规处理后前向运动精子群体的SDF时间变化，同时用CASA刻画更换或不更换培养液时精子活力参数的纵向变化。处理后精子平均活力存续13.4天，而存活率持续明显更长，为35–50天；前向运动精子SDF在D0与D6间相当，长时间孵育则显著升高；CASA显示关键活力参数随时间进行性下降，而定期更换培养液的样本活力存续延长，且活力参数在孵育第一周早期维持在相对稳定范围。
孵育期间SDF前6天稳定、此后显著升高，其机制可能是多因素的。ROS升高可诱导氧化应激及随后的DNA损伤；有研究发现ROS水平升高25%与DNA碎片化增加10%相关，并伴总抗氧化活性升高。ROS可直接与DNA核苷酸作用导致氧化性DNA损伤；一氧化氮和超氧离子等其他精子来源代谢物也可能参与。长时间体外孵育中，代谢副产物蓄积引起的pH变化可能是SDF升高的另一原因，能量底物耗竭则可损害精子活力与抗氧化防御功能。
每3天更换培养液可延缓活力下降，凸显外在环境对精子功能存续的影响。PBS等简单培养液即可支持精子活动。但精子作为终末分化细胞，其内源性底物不可再生，底物消耗导致的功能衰退无法通过更换培养液逆转。VAP、VCL和VSL与男性生育潜能正相关，其中VAP被认为信息量最大；本研究中三者变化趋势相似。作为速度参数衍生比值的LIN、STR和WOB亦呈下降轨迹，这些变化可能反映培养液中能量底物进行性耗竭及代谢副产物蓄积所致的结构损伤。ALH与BCF为源自VAP的次级活力参数。ALH反映精子头偏离平均轨迹的距离，可作为精子超活化的标志；高ALH伴高程度鞭毛弯曲受富钙培养液支持。不更换培养液样本中D4后可见ALH的波动性下降，可能源于钙耗竭；但定期更换培养液样本亦呈波动性ALH下降，提示长时间孵育早期的能量底物耗竭与ROS诱导的结构损伤可能无法通过更换培养液完全逆转。BCF与体外受精结局的关系尚无定论，现有研究报告不一致。
经适当处理后在常温孵育，人类精子表现出延长的体外活力与存活率。与许多既往研究不同，本研究专门评估前向运动精子组分而非全部精子群体的SDF，因ART操作仅选择前向运动精子。精子冷冻保存是长期生育力保存的成熟有效策略，现已常规用于ART，但已被证明可通过氧化应激诱导DNA损伤。相反，短期常温孵育期间前向运动精子维持较低SDF水平，提示其为短期（6天）精子保存提供了可能安全且经济、可避免冷冻保存复杂性的替代方案。
在常规ART实践中，男方通常需在取卵当日提供精液样本。具有可接受活力与DNA完整性的精子短期保存，可使精液采集时间安排更具灵活性。卵母细胞IVM已成为一种新型ART方法，尤其适用于多囊卵巢女性；但临床实践中IVM常需在取卵与受精之间延迟24–48小时，期间取卵当日采集的精液样本可能无法即时使用。本研究结果提示，适当处理后常温保存6天的精子SDF水平与新鲜处理样本相当，支持在受控条件下灵活处理精子的潜在临床价值。
本研究存在若干局限性。第一，样本量有限，需更大队列验证。第二，所选参与者精液样本具有WHO定义的可接受浓度与活力，精液参数欠佳者被排除，可能限制结果的外推性；未来研究应对不同生育特征男性进行分层分析。此外，由于工作的探索性质与实际限制，培养液更换与不更换的影响未在完全相同的精液样本中检验；人类精液参数的高样本间变异与非配对设计可能引入混杂因素，故观察到的效应应视为初步趋势，未来需在更大队列中采用严格配对实验设计。第三，实验条件值得考虑。精子上游与培养液更换操作需离心（400 g，2分钟），虽相对温和，但可能通过机械应激与ROS诱导对DNA完整性产生潜在影响；缺少仅离心的对照组是一潜在局限，因所观察到的结果无法明确归因于营养耗竭与代谢物蓄积，而非反复离心的影响。精子保存于常温而未精确控温，最佳温度范围有待进一步研究。值得注意的是，本研究所用培养液基于MOPS缓冲体系，有研究提示MOPS可能对精子活力、运动学参数和线粒体潜能产生负面影响；尽管本研究各组均使用单一培养液评估，仍应考虑该培养液特定成分对精子参数的潜在混杂效应。最后，制备精子样本在常温长时间保存后用于ART的长期临床安全性与生殖结局尚不清楚，应通过前瞻性临床试验与随访研究加以探讨。
**结论（译自原文）**：总之，本先导性研究证明，经常规处理的人类精子在常温体外孵育期间能够维持活力8–18天、存活率35–50天。定期更换培养液可延长活力存续时间。然而，存活超过9天的前向运动精子表现出DNA碎片化升高趋势，提示临床应用需在精子存续时间与基因组完整性之间取得平衡。
